中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (1): 48-52   PDF    
引用本文
王从军, 陈梅, 雷中劲等.髓系相关蛋白8和14在川崎病患儿中的表达及其与循环内皮细胞的关系[J]. 中国当代儿科杂志, 2014, 16(1): 48-52.  
WANG Cong-Jun, CHEN Mei, LEI Zhong-Jing et al. Expression of myeloid-related protein complex in association with circulating endothelial cells in children with acute Kawasaki disease[J]. CJCP, 2014, 16(1): 48-52.   
髓系相关蛋白8和14在川崎病患儿中的表达及其与循环内皮细胞的关系
王从军1, 陈梅1, 雷中劲2     
1 湖北省荆楚理工学院医学院, 湖北 荆门 448000;
2 湖北省荆门市第一人民医院儿科, 湖北 荆门 448000
2013-06-21 收稿, 2013-07-22 改回。
基金项目：湖北省教育厅优秀中青年人才项目(Q20104302)。
作者简介：王从军，男，博士，副教授，副主任医师。
摘要：目的 研究髓系相关蛋白8、14(MRP-8、-14)在川崎病(KD)患儿中的表达及其与循环内皮细胞数(CECs)的关系。方法 选取41 例KD患儿为研究对象，根据有无冠状动脉扩张分为冠状动脉无扩张KD组和冠状动脉扩张KD组，同时选取年龄和性别与KD患儿相匹配的因急性上呼吸道感染发热的40例患儿为对照组。分别通过ELISA、RT-PCR和流式细胞术检测各组患儿外周血MRP-8/MRP-14二聚体含量、单个核细胞MRP-8和MRP-14 mRNA表达水平及CECs。Pearson积差相关分析法分析MRP-8/MRP-14二聚体含量与CECs的相关性。结果 冠状动脉扩张KD组患儿MRP-8/MRP-14二聚体含量、单个核细胞MRP-8和MRP-14 mRNA表达水平及CECs均高于冠状动脉无扩张KD组(均P<0.05)，且两组上述指标均高于对照组(均P<0.05)；MRP-8/MRP-14二聚体含量与CECs呈正相关(r=0.69，P<0.05)。结论 MRP-8、MRP-14表达增高在KD的发病中起重要作用，且与CECs增高显著相关，是引起KD患儿血管损伤、冠状动脉扩张的重要因素。
关键词： 髓系相关蛋白     川崎病     循环内皮细胞     儿童    
Expression of myeloid-related protein complex in association with circulating endothelial cells in children with acute Kawasaki disease
WANG Cong-Jun1, CHEN Mei1, LEI Zhong-Jing2     
Medical College, Jingchu University of Techology, Jingmen, Hubei 448000, China
Abstract：Objective To investigate the expression of myeloid-related protein complex (MRP-8/14) in children with acute Kawasaki Disease (KD). Methods A total of 41 children with acute KD and 40 age-and sex-matched control children with upper respiratory tract infection were recruited. Serum levels of MRP-8/MRP-14 complex were measured by ELISA, messenger ribonucleic acid (mRNA) abundance of MRP-8 and MRP-14 in circulating granulocytes and monocytes was determined by RT-PCR, and the number of circulating endothelial cells was determined by flow cytometry. Results When the analysis was stratified according to the presence or absence of coronary artery ectasia in the KD patient group, serum levels of MRP-8/MRP-14 complex, MRP-8 and MRP-14 mRNA abundance in granulocytes, and the number of circulating endothelial cells were all significantly higher in KD patients with coronary artery ectasia than in KD patients without coronary artery ectasia (P<0.05). Serum levels of MRP-8/MRP-14 complex were positively correlated with the number of endothelial cells in the circulation (r=0.69, P<0.05). Conclusions Serum levels of MRP-8/MRP-14 complex are elevated in a positive association with the number of circulating endothelial cells in KD children with coronary artery ectasia, suggesting a causative role in the development of coronary artery lesions.
Key words: Myeloid-related protein     Kawasaki disease     Circulating endothelial cell     Child    

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种好发于 5岁以下儿童的急性全身性非特异性的血管炎综合 征，目前KD的病因和发病机制还不完全清楚， 一般认为血管内皮细胞损伤是KD的基础病变。髓系相关蛋白8、14(myeloid-related protein-8 and -14,MRP-8、-14)是S100钙结合蛋白家族成员， 主要通过钙离子依赖性方式形成特殊的异二聚体 MRP-8/MRP-14而发挥作用。已有研究表明MRP- 8/MRP-14蛋白复合体能与内皮细胞结合，导致血 管内皮细胞损伤 [1] ，在系统性血管炎的炎性活动中 起重要作用 [2] 。鉴于KD的基本病理改变及MRP- 8/MRP-14对内皮细胞的作用，有理由认为MRP- 8/MRP-14高表达在KD的发生过程中起重要作用， 为了明确二者之间关系，本研究对41例KD患儿 和40例一般发热患儿的血清MRP-8/MRP-14含量 和循环单个核细胞MRP-8 mRNA、MRP-14 mRNA 表达进行了检测并与循环内皮细胞数(circulating endothelial cells,CECs)进行比较，报道如下。

1 资料与方法
1.1 研究对象

选取2010年3月至2011年9月于荆门市第 一人民医院儿科住院的41例KD患儿为研究对象 其中男24例，女17例，年龄2个月~5岁，所有 患儿均符合2004年美国儿科学会和心脏病学会联 合制定的川崎病诊断标准 [3] ，且回顾性诊断没有误 诊。根据彩色多普勒超声诊断是否合并冠状动脉 扩张，将41例KD患儿分为冠状动脉扩张KD组 (n=15)和冠状动脉无扩张KD组(n=26)，同时 选取同期年龄和性别相匹配的急性上呼吸道感染 发热患儿40例为对照组。

1.2 方法
1.2.1 样本采集

　采集所有患儿外周静脉血 5 mL，其中1 mL用EDTA抗凝后离心分离血浆 于-70℃冰箱保存待测MRP8/MRP14；余4 mL肝 素抗凝后即刻分离外周血单个核细胞，一部分于 12 h内提取RNA用于RT-PCR的检测，一部分用 于流式细胞检测。

1.2.2 主要试剂

　人MRP-8/MRP-14 ELISA试 剂盒由美国R＆D systems公司生产，CD45-PE- Cy5、CD146-PE单抗均由美国Beton-Dickinson公司生产。

1.2.3 ELISA法测定血清MRP-8/MRP-14二聚体含量

　用纯化的人MRP-8/MRP-14抗体包被微孔 板，制成固相抗体。在包被MRP-8/MRP-14单抗 的微孔中加入待检标本，再与生物素化的人MRP- 8/MRP-14抗体结合，形成免疫复合物连接在板上， 洗涤后再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和 素，彻底洗涤后加入TMB显色液显色，酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算 样品中MRP-8/MRP-14浓度。

1.2.4 RT-PCR法检测外周血单个核细胞中MRP-8及MRP-14 mRNA水平

　采用Ficoll分 离外周血单个核细胞，抽提总RNA，逆转录合 成cDNA。引物用Primer 5.0软件设计，由武汉意 德生物技术有限公司设计合成，MRP-14上游引 物：5'-TCCACCAATACTCTGTGAAGCTG-3'，下 游引物：5'-CCTCCATGATGTGTTCTATGACC-3'， 片段长度201 bp；MRP-8上游引物： 5'-AATTGCTAGAGACGAGTGTCCTCA-3'，下 游引物：5'-TGCCACGCCCATCTTTATCA-3'， 片段长度105 bp；GAPDH上游引物： 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物： 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'，片段长度 271 bp。PCR反应体系：10×PCR buffer 5μL， 10 mM dNTPMix 5μL，RT-PCR产物cDNA 2μL，上、 下游引物(20μmol/L)各0.5μL，Taqpolymerase 0.25μL，灭菌水补足总反应体系体积为50μL。反 应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃ 退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延 伸10 min。PCR产物于2%琼脂糖凝胶上进行电泳， 采用Kodak Digital Science System DC40凝胶成像系 统对图像进行采集，应用图像分析软件进行各条 带平均灰度值分析，以同时扩增的GAPDH为内参 照，用目的基因条带灰度与GAPDH条带灰度比值 表示目的基因相对表达量。

1.2.5 流式细胞术测定CECs

　Ficoll分离外周 血单个核细胞，取50μL备测细胞悬液到已加入 10μL CD45-PE-Cy5、CD146-PE的专用流式试管中，振荡混匀，室温避光孵育15 min，加入溶血 剂500μL，振荡混匀，室温避光孵育10 min，完 全溶血后在15 min内上流式细胞仪检测。根据同 期患者血常规检查结果中每毫升淋巴细胞(L)及 单核细胞(M)绝对数，结合流式细胞仪测得的内 皮细胞与单个核细胞比例(R%)计算每毫升中的 CECs：CECs=(L+M)×R%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计 学分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表 示，多组间比较采用F检验，组间两两比较采用 SNK-q检验，MRP-8/MRP-14含量与CECs的关系 采用Pearson积差相关分析法进行分析。P<0.05为 差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组血清MRP-8/MRP-14含量比较

3组间血清MRP-8/MRP-14含量差异有统计 学意义(F=396.87，P<0.001)，其中冠状动脉扩 张KD组MRP-8/MRP-14含量(1799±250 ng/mL) 高于冠状动脉无扩张KD组(1185±195 ng/mL) (P<0.05)，且两组的MRP-8/MRP-14含量均高于 对照组(280±139 ng/mL)(均P<0.05)。

2.2 各组MRP-8和MRP-14 mRNA水平比较

冠状动脉扩张KD组MRP-8和MRP-14 mRNA表达水平均高于冠状动脉无扩张KD组(均 P<0.05)，且两组MRP-8和MRP-14 mRNA表达 水平均高于对照组(均P<0.05)。见图 1，表1。

图 1 各组MRP-8及MRP-14 mRNA RT-PCR电泳图 M：Marker；1：对照组；2：冠状动脉无扩张KD组；3：冠状动脉扩张KD组。

表 1各组血清MRP-8和MRP-14 mRNA水平比较　(x±s)

2.3 各组CECs比较

3组间CECs差异均有统计学意义(F=133.23、 P<0.001)，其中冠状动脉扩张KD组CECs(588± 110/mL)高于冠状动脉无扩张KD组(392± 160/mL)(P<0.05)，且两组CECs均高于对照组 (66±43/mL)(均P<0.05)。见图 2。

图 2 各组CECs流式细胞仪检测图 图中方框内所示为各组CECs。

2.4 CECs与血清MRP-8/MRP-14含量相关性

Pearson积差相关分析显示，KD患儿CECs与 血清MRP-8/MRP-14含量呈显著正相关(r=0.69， P<0.05)。见图 3。

图 3 CECs与血清MRP-8/MRP-14含量线性相关图

3 讨论

KD是一种好发于5岁以下儿童的急性全身性 非特异性的血管炎综合征，容易侵犯冠状动脉， 部分患儿形成冠状动脉瘤，是引起儿童后天性心 脏病的主要原因 [4] ，至今KD的病因和发病机制还 不完全清楚。一般认为KD可能的发病机制是在具 有遗传易感体质基础上，由于感染因素的影响而 发生的异常免疫应答导致T淋巴细胞、B淋巴细胞 及单核-巨噬细胞激活后释放细胞因子，引起血 管内皮细胞的损伤而出现相应的临床表现 [5]。

MRP-8、MRP-14又称S100A8、S100A9蛋 白，是S100钙结合蛋白家族成员，主要通过钙离 子依赖性方式形成特殊的异二聚体MRP-8/MRP- 14而发挥作用 [6] 。MRP-8/MRP-14具有广泛的细 胞内和细胞外生物学功能，能被特异性地分泌至 炎症病灶处，是中性粒细胞化学趋化性和黏附性 强有力的诱导剂，并与炎症高度相关 [7] ，在各种 急慢性炎性病变中起主要作用，如类风湿性关节 炎、炎性肠病都发现MRP-8/MRP-14二聚体浓度 升高 [8, 9] 。已有研究表明MRP-8/MRP-14蛋白复合 体能通过硫酸乙酰肝素蛋白多糖或羧基-N-葡 聚糖作用与内皮细胞结合 [10] ，表明MRP-8/MRP- 14与血管内皮细胞有重要的相互作用。在体外人 类微血管内皮细胞中MRP-8/MRP-14能诱导血栓 形成导致血小板粘附、聚集和炎症反应，增加血 管内皮细胞的通透性，破坏内皮细胞单层的完整性，表明MRP-8/MRP-14与系统性血管炎的炎 性活动密切相关。

本研究检测了41例KD患儿和40例普通发 热患儿血清MRP-8/MRP-14二聚体含量和外周血 单个核细胞MRP-8、MRP-14 mRNA表达，结果显 示KD患儿血清MRP-8/MRP-14二聚体含量和外周 血单个核细胞MRP-8、MRP-14 mRNA表达均明显 高于对照组，且上述指标在伴有冠状动脉扩张的 KD患儿中要高于无冠状动脉扩张的KD患儿，证 实MRP-8、MRP-14在KD的发病中起重要作用， 是引起冠状动脉扩张的重要因素，推测KD发病过 程中存在免疫系统的异常激活，活化的T细胞、B 细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞分泌MRP-8、 MRP-14从而介导了血管内皮细胞的损伤，但致病 因素如何激活炎性细胞导致MRP-8、MRP-14的高 表达机制还不清楚。

CECs为脱落的血管内皮细胞，20世纪70 年代由Bouvier提出，能表达较为具有特异性的 CD146膜糖蛋白，在正常人血中数量极少，而在 很多血管损伤性疾病如肿瘤形成和心血管疾病等 情况下数量可明显增加，可作为血管损伤的标记 物 [12, 13, 14, 15] 。本研究在检测MRP-8、MRP-14 mRNA的 同时采用特异性的CD-146单抗标记并与外周血白 细胞作比较通过流式细胞仪检测了CECs，结果显 示KD患儿CECs较因急性上呼吸道感染而发热的 普通发热患儿明显增加，且伴有冠状动脉扩张的 KD患儿CECs高于无冠状动脉扩张的KD患儿， 进一步证实血管内皮细胞的损伤是KD发病并导 致冠状动脉扩张的重要原因。通过MRP-8/MRP-14 与CECs进行Pearson积差相关性分析显示二者呈 正相关，说明KD患儿血管内皮细胞的损伤系由 MRP-8/MRP-14介导所致，具体作用的分子机制还 需进一步研究明确。

参考文献
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