中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (1): 67-72   PDF    
引用本文
王华, 母得志.PirB抑制缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织神经再生[J]. 中国当代儿科杂志, 2014, 16(1): 67-72.  
WANG Hua, MU De-Zhi. Neuroregeneration of newborn rats with hypoxic-ischemic brain damage following antibody-mediated neutralization of paired-immunoglobulin-like receptor B[J]. CJCP, 2014, 16(1): 67-72.   
PirB抑制缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织神经再生
王华, 母得志     
四川大学华西第二医院新生儿科, 四川 成都 610041
2013-09-04 收稿, 2013-09-25 改回。
基金项目：国家自然科学基金(81070521，81330016)；四川省科技厅科技支撑项目(2010SZ0111)。
作者简介：王华，女，博士，副主任医师。
通信作者：母得志，男，教授。
摘要：目的 观察缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后新生大鼠脑组织中髓鞘抑制因子配对免疫球蛋白B(PirB)的表达变化，以及抑制PirB对缺氧缺血性神经损伤的保护作用。方法 66只新生Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组(n=30)、HIBD组(n=30)和抗PirB抗体组(n=6)，采用结扎右侧颈总动脉和低氧(8% O2)处理3 h造模，假手术组分离右侧颈总动脉但不予结扎及缺氧处理；HIBD组在完成结扎手术及缺氧处理后，两组分别在0 h、6 h、12 h、24 h和72 h各处死6只大鼠；抗PirB抗体组在完成结扎手术及缺氧处理后即刻从脑室内注入PirB抗体，于72 h后处死。采用免疫组化、Western blot和RT-PCR方法检测HIBD后各时间点新生鼠脑组织内PirB蛋白及mRNA含量的变化，同时免疫沉淀法测定Rho激酶(ROCK)活性在HIBD 72 h后的变化以及抗PirB抗体对ROCK活性的影响。结果 PirB mRNA和蛋白均在HIBD 72 h后的新生鼠脑组织中表达升高，与HIBD后0 h比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。HIBD后 72 h，新生鼠脑组织中ROCK蛋白活性高于假手术组和抗PirB抗体组(均P<0.05)。结论 抑制PirB可能是促进HIBD后神经再生的一个新治疗方法，而该抑制作用可能是通过Rho-ROCK信号通路产生的。
关键词： 配对免疫球蛋白B     神经再生     脑组织     缺氧缺血     新生大鼠    
Neuroregeneration of newborn rats with hypoxic-ischemic brain damage following antibody-mediated neutralization of paired-immunoglobulin-like receptor B
WANG Hua, MU De-Zhi     
Department of Neonatology, West China Second Hospital Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract：Objective To study changes in paired-immunoglobulin-like receptor B (PirB) expression after hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) as well as the role for targeted inhibition of PirB activity in nerve regeneration in rats. Methods Newborn Sprague-Dawleyrats rats were divided into: a sham operation group (n=30), a HIBD group (n=30), and an anti PirB antibody treatment group (n=6). In the HIBD group, HIBD was induced by right carotid artery ligature and subsequent exposure to hypoxia (8% O2) for 3 hours. In the sham operation group, right carotid artery was dissected as in the HIBD group but no ligature and hypoxic exposure was not applied. In the two groups, 6 animals were sacrificed at 0, 6, 12, 24 and 72 hours after the operation and hypoxic exposure. In the antibody treatment group, after carotid artery ligation and hypoxia exposure as in the HIBD group, an anti PirB antibody was injected intracerebrally and animals were sacrificed 72 hours after the injection. Immediately after sacrifice of the animals at designated time points, brain tissue specimens were collected. The presence and content of PirB protein were assessed by immunohistochemistry and Western blot analysis respectively, the abundance of PirB mRNA was determined by RT-PCR, and the Rho kinase (Rock) activity was determined by immunoprecipitation. Results At 72 hours after operation, PirB mRNA abundance and protein content in the brain were significantly increased as compared with the measurements at 0 hour after operation in the HIBD group (P<0.05); ROCK activity was significantly increased in the HIBD group as compared with the sham operation and anti PirB antibody groups (P<0.05). Conclusions PirB might be involved in HIBD through a Rho-ROCK-dependent mechanism and antibody-mediated neutralization of PirB in the brain may offer a novel therapeutic strategy for HIBD.
Key words: Paired immunoglobulin-like receptor B     Neuron regeneration     Brain tissue     Hypoxia-ischemia     Newborn rats    

缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalo- pathy,HIE)是新生儿期十分常见的脑损伤，但是至 今为止，对该疾病的治疗仍停留在对症处理及减轻 脑损伤后遗症的一些方法上 [1] ，还没有发现促进损 伤神经再生的有效方法。因此，目前急需进行对于 缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage HIBD)后促进神经再生的新方法的研究 [2] 。中枢 神经系统再生受抑制的一个主要原因在于损伤轴突 所处的环境中有大量的髓鞘抑制因子，最近的研究 表明以MAG、Nogo-A和Omgp为主要的抑制因子[3]。 这3种髓鞘抑制因子在HIBD神经再生中是通过 与受体NgR结合，形成受体复合物后发挥抑制作 用 [4, 5, 6, 7] 。已有一些文章表明抑制NgR可以促进损伤 神经再生 [8] ，但是也有一些文章表明髓鞘抑制因子 在NgR敲除鼠和野生鼠中的抑制神经再生作用无 差异 [9] 。因此，很有可能存在第二个受体介导髓鞘 抑制因子的抑制作用。配对免疫球蛋白B(paired Immunoglobulin-like receptor B,PirB)首先被发现表 达于免疫系统细胞上，直到最近才发现也表达在 神经细胞上 [10] 。与NgR一样，PirB可以与MAG、 Nogo-A和Omgp结合并发挥神经再生抑制作用。同 时阻止NgR和PirB可能可以完全阻止髓鞘抑制因 子对损伤神经再生的抑制作用，对敲除NgR的神 经元用抗PirB抗体处理后能部分阻断通过Nogo-66 而发生的抑制损伤神经再生作用 [11] 。这些实验结 果均表明联合阻止NgR和PirB可能会促进损伤神 经的再生。

本研究假设抑制PirB可以通过阻止抑制因 子传导通路从而刺激损伤神经再生，另外，由于 PirB和NgR都是髓鞘抑制因子的受体，而NgR是 通过Rho-ROCK信号通路而发挥抑制作用的，因 此本研究假设PirB也是通过这一信号通路发挥作 用。本实验将探讨PirB在HIBD新生大鼠脑组织 中的含量及表达变化，并测定Rho激酶(ROCK) 的活性变化，以便探讨PirB抑制HIBD神经再生 可能的信号通路，旨在为寻求促进损伤神经再生 的新方法而奠定基础。

1 材料与方法
1.1 主要试剂

一抗PirB(C19，美国Santa Cruze公司)；二抗生物素标记兔抗羊IgG、SP免疫组化Kit试剂 盒、DAB显色试剂盒(北京中山公司)；RIPA裂 解液(上海申能博彩生物科技有限公司)；丽春 红S染色试剂和考马斯亮蓝染色试剂(美国Sigma 公司)；PVDF膜(德国罗氏公司)；Western blot Kit(美国KPL公司)；PirB、β-actin引物(上海 捷倍思基因技术有限公司)；总RNA提取试剂盒 (MBI公司)；First Strand CDNA synthesis Kit、 dNTPmix、BCA试剂盒(深圳晶美生物有限工程公 司)；DEPC(成都云鸿科技公司)。

1.2 HIBD新生大鼠模型建立

66只清洁级健康7 d龄Sprague-Dawley新生 大鼠(购于华西实验动物中心)，随机选取6只 为抗PirB抗体组，余60只大鼠被随机分为假手术 组及HIBD组，每组30只。新生大鼠仰卧位固定， 乙醚吸入麻醉，切开皮肤及皮下组织，分离右侧 颈总动脉，并用7-0灭菌丝线结扎，缝合皮下 组织及皮肤，并再次消毒皮肤。整个手术过程在 15 min内完成。术后将大鼠置于常氧空气中 30 min后，将其放进8%O2、92%N2混合气体的 低氧舱处理3 h，流量为2 L/min，低氧处理结束后 的新生鼠放回含常氧的母鼠笼中饲养。假手术组 仅将丝线穿过右侧颈总动脉而不做结扎及缺氧处 理，HIBD组在完成结扎手术及缺氧处理后，两组 分别在0 h、6 h、12 h、24 h和72 h各处死6只大 鼠。抗PirB抗体组在完成结扎手术及缺氧处理后 即刻从脑室内注入PirB抗体，于72 h后处死。

1.3 免疫组化检测PirB蛋白表达
1.3.1 标本处理

　用3%戊巴比妥钠15~ 20 mg/kg对每个时间点动物作腹腔内麻醉，打开腹 腔麻醉后新生鼠的胸腔，用20 mL注射器于左心室 灌注生理盐水，同时在右心房处剪一切口，至流出 液体变清为止。再灌注4%多聚甲醛、0.1 mol/L PBS 100 mL，至肝脏明显变白及肺脏明显水肿后断头取 全脑，并立即将之保存于4%多聚甲醛、0.1 mol/L PBS溶液中固定72 h以上。将固定的鼠脑从视交叉 后2~6 mm处做脑组织冠状切面，取视交叉之后的 脑组织块经梯度酒精脱水、二甲苯透明后行石蜡包 埋，切片后裱于载玻片上备用。切片厚度为5μm， 每5张切片取1张，每个动物脑组织共取3张切片， 每张切片随机选5个视野观察。

1.3.2 PirB免疫组化步骤

　标本脱蜡置水，3%H2O2浸泡消除内源性过氧化物酶，蒸馏水洗 5 min，两次，柠檬酸修复液抗原修复，3%正常羊 血清封闭，滴加PirB一抗，37℃孵育0.5 h，然后 4℃过夜，滴加二抗，37℃孵育1 h，滴加SP，再 37℃孵育1 h，DAB显色试剂盒显色，苏木素复染， 脱水、透明、封片。

1.4 Western blot检测PirB蛋白表达

提取脑组织蛋白质，假手术组及HIBD组各 时间点各6例标本，冰浴中取脑组织100 mg加入 1 mL RIPA和10μL PMSF，用1 mL TIP管直接吸打 冰里放置30 min，离心，采用紫外可见分光光度 仪测定蛋白浓度，各样本稀释为5μg/μL，-70℃ 冰箱保存；配置好分离胶后，取样本上样，恒压 120 V电泳1 h，凝胶转移至固相支持物，膜封闭， 杂交显色(一抗为C19)，进行图像采集及统计学 分析。

1.5 RT-PCR检测PirB mRNA表达

分别取假手术组和HIBD组新生大鼠术后各 时间点的右侧大脑皮层组织约40 mg置于DEPC 处理过的1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol剧烈 振荡，离心后将上清液移至DEPC处理的EP管 中，行脑组织总RNA提取，用紫外分光光度仪 测得总RNA提取物的A260/280值在1.6~2.0之 间，再将提取的总RNA行1%琼脂糖凝胶电泳， 将模板RNA、Oligo(dT)与DEPC处理水轻微混 匀，孵育后冰上冷却离心。根据NCBI Genebank 中大鼠PirB、β-actin基因序列行引物设计，PirB 上游引物：5'-TCGGGGAAAATTCAGGAA-3'，下 游引物：5'-GAGA-AATCTCTAGCTTTATTT-3'， 片段长度：124 bp；β-actin上游引物： 5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3'，下游引物： 5'-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3'，片段长度 387 bp。cDNA的合成参照逆转录酶使用说明书 进行。反应体系(50μL)：模板cDNA 1μL， 10×Buffer 5μL，dNTP mix(2.5 mM)1μL，上、 下游引物(10μM)各1μL，Taq多聚酶0.5μL， ddH2O补足体积至50μL。反应条件：94℃预变性 3 min；94℃变性30 s，55℃(PirB)/53℃(β-actin) 退火30 s，72℃延伸32 s(PirB)/40 s(β-actin)， 32(PirB)/28(β-actin)个循环；最后72℃延伸 8 min。PCR扩增产物0.5μL和上样缓冲液0.3μL 点样于1%琼脂糖凝胶上，50 V电泳1 h后照相。用图像分析仪测照片上扩增产物的平均灰度，计 算出目的基因条带灰度值与内参β-actin条带灰度 值的比值作为目的基因的相对表达量。

1.6 免疫沉淀法检测ROCK蛋白活性

标本匀浆后加0.5 mL预冷细胞裂解液，4℃、 12000 rpm离心10 min后收集上清，BCA法平衡 每组蛋白总浓度，准备A蛋白-Sepharosez珠及其 PirB一抗复合物，按每50μL A蛋白-Sepharosez 珠中加入10μL PirB一抗(C19)，4℃孵育1 h， 8000 rpm离心5 min，PBS洗涤3次，加50μL PBS，取100μg总蛋白，加入A蛋白-Sepharosez 珠PirB一抗复合物后离心，蛋白上清储于-20℃ 冰箱备用；制备电泳凝胶、进行SDS-PAGE、转膜 和免疫反应，以GADPH作为内参对照，最后进行 ECL曝光及条带半定量分析。

1.7 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两 组均数的比较采用t检验；多组间均数比较采用单 因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 PirB在HIBD新生大鼠脑组织中的表达变化

本实验首先采用免疫组化法测定了HIBD组 新生大鼠在各时间点脑组织中PirB的表达，结果 表明HIBD组72 h时的PirB阳性表达(黄褐色) 明显增加，与HIBD后0 h及假手术组相比差异均 有统计学意义(均P<0.05)。而假手术组各时间 点PirB差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图 1， 表1。

表 1假手术组与HIBD组PirB表达水平比较　(x±s)

图 1 HIBD新生大鼠脑组织各时间点免疫组化图像 (DAB显色，×200)　黄褐色为PirB阳性表达。

Western blot检测结果与免疫组化结果一致， PirB蛋白表达在HIBD 72 h后的新生鼠脑组织中明 显增加，与其他时间点比较差异均有统计学意义(均 P<0.05)，见图 2。

图 2 Western blot检测HIBD组新生鼠各时间点脑组 织PirB表达水平(n=6) A：Western blot条带图；B:Western blot的半定量分析结果。a：与0 h、6 h、12 h和24 h相比， P<0.05。

2.2 PirB mRNA在HIBD新生大鼠脑组织中的变化

与免疫组化和Western blot结果一致，PirB mRNA在HIBD 72 h后的新生鼠脑组织中明显增 加。与其他时间点比较差异均有统计学意义(均 P<0.05)，见图 3。

图 3 RT-PCR检测HIBD组新生鼠各时间点脑组织 PirB mRNA表达水平(n=6) A：RT-PCR电泳图；B:RT-PCR 的半定量分析结果。a：与0 h、6 h、12 h和24 h相比，P<0.05。

2.3 ROCK蛋白活性在HIBD新生大鼠脑组织中的变化以及抗PirB抗体对其的影响

鉴于HIBD 72 h后脑组织中PirB蛋白及 mRNA明显增加，因此本实验主要观察HIBD 72 h 组中ROCK蛋白活性的变化，以及加入抗PirB抗 体对HIBD大鼠ROCK蛋白活性的影响。结果表明造模成功后72 h，HIBD组ROCK蛋白活性较假 手术组增加(P<0.05)，抗PirB抗体组ROCK蛋 白活性较HIBD组降低(P<0.05)。表明ROCK蛋 白活性在HIBD新生鼠脑组织中增加，而且这种酶 活性的增加可以被抗PirB抗体所阻断。见图 4。

图 4 HIBD 72 h后ROCK蛋白活性在各组新生大鼠 脑组织中的变化(n=6) A：免疫沉淀条带图；B：免疫沉淀的 半定量分析结果。a：与假手术组相比，P<0.05；b：与HIBD组相 比，P<0.05。

3 讨论

HIBD是围生期窒息幸存儿中最为常见的致残 原因 [12] 。虽然到目前为止研究了各种各样的神经 保护措施，但是由于神经损伤的不可逆性，对于 HIE的治疗手段仍然十分有限。研究表明HIE预 后与神经损伤程度密切相关，本课题组以前的研究 观察到新生鼠脑组织HIBD后神经坏死，那么HI 损伤后成功的神经再生对HIBD的治疗十分重要。

ROCK在髓鞘抑制因子与其受体NgR结合后 发挥抑制神经再生作用的信号传递通路中发挥着 重要的作用。因此，本实验探索ROCK在PirB抑 制HI损伤神经再生中是否也发挥着同样重要的作 用。鉴于有研究表明，在中枢神经系统髓鞘中有 几种髓鞘抑制蛋白与抑制损伤神经再生相关，它 们是MAG、Nogo-A和Omgp，抑制蛋白要通过它 们的受体NgR发挥作用，而NgR发挥抑制作用要 通过RhoA-ROCK信号通路，因此本研究想通过实 验表明PirB是否也与抑制损伤神经再生有一定作 用，而这一作用是否也是通过ROCK信号通路介导。 形态学研究发现，HIBD新生大鼠脑组织中存在 着明显的神经元坏死表现 [13] 。另外，本课题组前 期的实验研究表明髓鞘抑制因子Nogo-A及其受体 NgR在HIBD脑组织中含量升高 [14] ，2007年有研 究提出Nogo-A抗体可导致HIBD新生大鼠脑组织 Nogo-A蛋白表达明显减少，对神经细胞再生的抑 制作用减弱 [15] 。2012年的研究表明PirB抑制新生大鼠HI损伤神经元细胞再生 [16, 17] ，提示Nogo-A、 NgR和PirB在阻止损伤神经再生方面起着一定作 用。目前表明Nogo-A、NgR的抑制机制是Nogo-A 通过与NgR-P75NTR受体复合物相结合，将抑制 信号传递至ROCK，再激活一系列瀑布反应，最终 导致细胞骨架结构重建而抑制损伤神经元再生。 由于PirB是新近发现的Nogo-A的另一种功能性受 体，因此本研究推测抑制PirB可能也可以通过抑 制ROCK的表达继而起到促进损伤神经元再生的 目的。

为了表明PirB在HIBD新生鼠的脑组织中含 量是否增加，本研究在免疫组化中用针对PirB胞 内段的特异性抗体，对不同HI时间点脑组织中 PirB的含量进行比较，发现HIBD后72 h新生鼠 脑组织中PirB的分布及含量增加，主要分布于大 脑皮层、海马及小脑神经元中。同时本研究采用 Western blot和RT-PCR检测表明新生鼠HIBD后 72 h PirB蛋白及mRNA的含量均增加。

PirB作为髓鞘抑制因子的功能性受体，抑制 损伤神经元轴突再生的机制是否也同NogoA-NgR 类似，是通过Rho-ROCK信号通路改变细胞骨架 结构而发挥抑制作用的呢？本课题组前期体内动 物实验中观察到HIBD后Rho的含量及活性均增 强，但加入抗PirB抗体后其活性下降 [15, 16] 。说明 HI致髓鞘抑制因子增加，继而其受体含量也增加， 由于Rho-ROCK信号通路已被证实在Nogo受体复 合物抑制神经再生方面起着重要作用，因此本实 验力图表明PirB这一髓鞘抑制因子的功能性受体 也可能是通过这一条信号通路发挥着抑制神经再 生的作用。因此，本研究通过脑室内注入抗PirB 胞外段的特异性抗体，培养阻断PirB表达的HIBD 后72 h的脑组织，结果表明HIBD后72 h ROCK 活性增加，而抑制PirB后ROCK活性下降，表明 PirB在HIBD后增加会抑制损伤神经元再生，其机 理可能与ROCK的激活有一定关系，而抑制PirB 可能是治疗HIBD的一个潜在靶点。

在接下来的实验中，本课题组将进一步进行去 除PirB功能的转基因动物实验，从动物体内研究 无PirB表达时HIBD后不同时间点神经元再生的情 况及Rho-ROCK信号通路的变化，以期进一步证实 PirB在HIBD后起着抑制神经元轴突再生的作用及 其可能机制。

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