中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (1): 73-76   PDF    
引用本文
李晋辉, 李德渊, 陈大鹏等.整合素β8在星形胶质细胞氧糖剥夺后对TGF-β1的活化影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2014, 16(1): 73-76.  
LI Jin-Hui, LI De-Yuan, CHEN Da-Peng et al. Effect of integrin β8 on TGF-β1 activation in astrocytes with oxygen glucose deprivation[J]. CJCP, 2014, 16(1): 73-76.   
整合素β8在星形胶质细胞氧糖剥夺后对TGF-β1的活化影响
李晋辉, 李德渊, 陈大鹏, 母得志, 屈艺     
四川大学华西第二医院儿科/华西儿童医学中心, 出生缺陷相关妇儿疾病教育部重点实验室, 四川 成都 610041
2013-06-17 收稿, 2013-07-15 改回。
基金项目：国家重大科学研究计划项目(2013CB967404)；国家自然科学基金(31171020、81172174、81270724、81100457)；四川省科技厅科技支撑项目(2010SZ0280、2013SZ0031)；国家临床重点专科(儿科新生儿专业)建设项目。
作者简介：李晋辉，女，博士，讲师。
通信作者：屈艺，女，博士，研究员。
摘要：目的 探讨在氧糖剥夺(OGD)后，星形胶质细胞中整合素β8(β8)的表达对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的影响。方法 体外培养星形胶质细胞，OGD模拟缺氧缺血。免疫细胞化学法检测β8蛋白在星形胶质细胞中的表达及分布，Western blot定量检测OGD处理后复氧12 h、1 d及2 d 时β8蛋白表达的变化。建立星形胶质细胞与荧光素酶报道细胞(TMLC)共培养体系，利用RNA干扰技术抑制星形胶质细胞β8表达，观察β8对TGF-β1活化的影响。结果 β8主要分布于星形胶质细胞的胞浆和树突；星形胶质细胞中β8蛋白表达在复氧后12 h即有增加，1 d时达高峰；星形胶质细胞与TMLC共培养体系在复氧后各时间点TGF-β1活性增高趋势与星形胶质细胞β8表达趋势相似，抑制β8表达后，TGF-β1活性在各时间点均显著降低。结论 新生鼠在缺血缺氧时，星形胶质细胞高表达的β8对中枢神经系统中TGF-β1的活化起重要调控作用。
关键词： 缺氧缺血     星形胶质细胞     整合素     转化生长因子     新生大鼠    
Effect of integrin β8 on TGF-β1 activation in astrocytes with oxygen glucose deprivation
LI Jin-Hui, LI De-Yuan, CHEN Da-Peng, MU De-Zhi, QU Yi     
Department of Pediatrics, West China Second Hospital, Sichuan University; West China Children's Medical Center; Key Laboratory of Obstetric & Gynecologic and Pediatric Diseases and Birth Defects of Ministry of Education, Chengdu 610041, China
Abstract：Objective To study the effect of β8 expression on transforming growth factor β1(TGF-β1) activation in astrocytes with oxygen glucose deprivation (OGD). Methods Astrocytes were cultured and then subjected to OGD to generate hypoxia-ischemia (HI) model in vitro. Immunocytochemistry was used to detect the expression and distribution of β8 in nomoxia cultured cells. β8 protein expression was quantified by Western blot at 12 hours, 1 day and 2 days after OGD. Astrocytes and luciferase reporter cells (TMLC) were co-cultured. β8 RNA interference system was established to specifically inhibit β8 expression in cultured astrocytes. TGF-β1 activation was then detected in the co-culture system. Results β8 was mainly located in the cytoplasm and neurites of astrocytes. OGD resulted in increase of β8 protein expression at 12 hours after reoxygenation in astrocytes, which was peaked at 1 day after reoxygenation. TGF-β1 activation was in accordance with β8 expression in astrocyte-TMLC co-culture system after reoxygenation. After the inhibition of β8, TGF-β1 activation was significantly reduced in all time points. Conclusions The highly expressed β8 plays important roles in the regulation of TGF-β1 activation in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage.
Key words: Hypoxia-ischemia     Astrocyte     Integrin     Transforming growth factor     Newborn rats    

缺氧缺血(HI)是新生儿时期引起神经系统 损伤的重要原因，对缺氧缺血性脑损伤(HIBD) 发病机制及防治的研究具有重要意义。星形胶质 细胞是中枢神经系统(CNS)中数量最多的神经细 胞之一。近年来，越来越多的研究表明，星形胶 质细胞除了参与早期的血管发育，还参与了CNS 损伤后修复的调控，有十分重要的调控作用 [1, 2] 。 然而，星形胶质细胞是一种附着生长细胞，必须 在整合素的介导下，与周围基质及细胞相互粘着 才能存活和生长。整合素α v β 8 是星形胶质细胞表 达的主要整合素之一，因此可能对其功能起重要 调控作用。转化生长因子-β1(TGF-β1)具有调节 细胞生长、分化、调控炎症反应等作用 [3] ，以无活 性的潜伏态形式分泌，在CNS中尤其是HI时，对 其活化途径仍不完全清楚。β 8 是位于细胞表面的 主要TGF-β受体，研究表明，上皮细胞表达的β 8 可激活TGF-β1[4]。然而，在CNS中，β 8 是否也是 激活TGF-β1的关键因素，目前尚不十分清楚。

在体外培养环境中，氧糖剥夺(OGD)模拟 HI后星形胶质细胞β 8 表达是否诱导性增高？表达 增高的β 8 能否诱导TGF-β1活化水平增高，从而影 响一系列下游调节蛋白高表达？本课题组认为这一 连锁反应是新生儿HIBD细胞修复的重要机制之一。 这一假设亟待进一步证实，也是本研究的核心内容。

1 材料与方法
1.1 实验动物与材料

清洁级新生3 d(P3)Sprague-Dawley(SD)大 鼠，雌雄不限，平均体重12 g，由四川大学华西医 学中心实验动物中心提供。兔抗大鼠β 8 及β-actin 多克隆抗体、山羊抗兔IgG多克隆抗体购自Santa Cruz公司，ABC免疫化学试剂盒购自VECTOR Laboratories，DAB显色试剂盒购自KPL公司，荧光 素酶分析试剂盒购自Promega公司，抗TGF-β1抗 体1d11购自R&D公司。Western blot用兔抗大鼠β 8 多克隆抗体参照文献 [5] 以KLH偶联合成多肽(N'- EIKMDISKLNA-C')免疫动物获得。β 8 siRNA及对 照siRNA已由既往实验获得 [6] ，直接用于本实验。

1.2 原代星形胶质细胞培养

参照文献进行原代培养 [7] 。将新生大鼠脑膜 及血管组织分离后，取脑皮质并将其剪碎，加入含 0.25%胰蛋白酶的PBS液中，37℃消化5~10 min 后，加入10％胎牛血清(FBS)终止消化。通 过75μm不锈钢筛网过滤，收集细胞悬液，加入 DMEM培养基柔和吹打数次后以1200 rpm/min，离 心5 min，去上清液后加入培养液(高糖DMEM培养基+10%FBS)，于二氧化碳培氧箱中(37℃， 5%CO2)饱和湿度培养。接种3 d后更换培养液， 以后每两天半量换液1次。培养约15 d即为成熟 星形胶质细胞。

1.3 体外模拟缺氧缺血

OGD体外模拟HI。将成熟星形胶质细胞培 养基更换为无糖DMEM培养基，将细胞置于通混 合气(5%CO2+95%N2)的缺氧装置中，体外模拟 HI。6 h后更换为原培养液，并以正常条件继续培 养，模拟复氧。以未接受OGD处理的细胞作为对照， 分别采集对照组及复氧后12 h、1 d、2 d细胞标本 进行后续实验。

1.4 星形胶质细胞与荧光素酶报道细胞共培养

待荧光素酶报道细胞(TMLC)在96孔板中 贴壁后，将培养中的星形胶质细胞以相同密度接 种于生长有TMLC的96孔板中。以高糖培养液， 于37℃、5％CO2孵箱中培养。共培养2 d后，光 镜下观察星形胶质细胞覆盖于TMLC之上生长， 满足后续实验要求。

1.5 检测指标和方法
1.5.1 免疫细胞化学检测β8表达及分布

收集 正常生长的星形胶质细胞爬片，0.01M PBS清洗后， 4%多聚甲醛固定。3%H2O2封闭内源性过氧化物 酶10 min，10%山羊血清37℃孵育20 min，滴加 兔抗大鼠β 8 抗体(1:500)4℃孵育过夜。滴加山 羊抗兔IgG 37℃孵育30 min，加入ABC 37℃孵育 30 min，DAB显色试剂盒显色，显微镜下观察。

1.5.2 Western blot检测缺氧缺血后β8蛋白表达

　取对照组及复氧后12 h、1 d及2 d的细胞，0.25% 胰酶消化及离心后收集细胞沉淀，蛋白裂解液抽提 细胞蛋白。取上清，BCA法测蛋白浓度，各孔加 入100μg蛋白样品电泳，转膜，5%小牛血清封闭 液封闭1 h，加入兔抗大鼠β 8 多克隆抗体(1:100)。 TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次， ECL显色，用Gel-pro凝胶成像分析软件测定条带 的积分光密度值(IOD)，并计算目的蛋白和内参 β-actin的IOD比值，即为相对光密度。

1.5.3 TGF-β1活性的检测

　在星形胶质细胞和 TMLC共培养体系中，TMLC已被转染且能稳定表 达与TGF-β1起反应的启动子(PAI-1)，当PAI-1 被TGF-β1激活后，可启动其下游的虫媒荧光素酶 表达 [8] ，TGF-β1活性由荧光素酶强度反映。将共 培养体系中的星形胶质细胞与TMLC共同行OGD处理6 h后复氧，设未接受OGD处理组(对照组) 和复氧后12 h、1 d、2 d组共4组，每组根据不同 的处理方式再分为3个亚组：(1)β 8 +/+ /TMLC共 培养组(β 8 +/+ 组)；(2)β 8 -/- /TMLC共培养组(β 8 -/- 组)； (3)1d1(110μg/mL)处理的β 8 +/+ /TMLC组(anti-TGF-β 组)。其中，β 8 -/- 表示经RNA干扰的星形胶质细胞， β 8 +/+ 表示正常培养的星形胶质细胞。参照试剂盒说 明书检测，酶标仪读取荧光素酶数值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件包对数据进行统计学 分析。计量资料以均数±标准差表示(x±s)， 多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较 采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 β8蛋白在星形胶质细胞中的表达及分布

细胞免疫化学染色发现，常氧状态下，星形 胶质细胞即有大量β 8 蛋白表达，β 8 主要分布于星 形胶质细胞的胞浆和树突。见图 1。

图 1 免疫细胞化学检测β8在星形胶质细胞中的分布及 表达 (DAB显色，×400)　图A为常氧状态下星形胶质细胞，以 PBS代替一抗作为阴性对照；图B为常氧状态下星形胶质细胞β8表达， 箭头所示胞浆及树突显示棕黄色颗粒为β8阳性表达。

2.2 氧糖剥夺后星形胶质细胞β8蛋白表达的变化

将未接受OGD处理的对照组β 8 蛋白表达判 读结果定为1，复氧后各时间点结果以相对于对照 组的倍数来表示。Western blot结果显示，星形胶 质细胞中β 8 蛋白表达在复氧后12 h即有增加，为 对照组的1.3倍(P<0.01)；1 d时表达达高峰， 为对照组的2.3倍(P<0.01)；后表达缓慢下降， 至复氧后2 d时仍维持在较高水平，为对照组的1.9 倍(P<0.01)。见图 2。

图 2 OGD对星形胶质细胞β8蛋白表达的影响(n=5) 左图为条带图；右图为统计结果图，a：与对照组比较，P<0.01。

2.3 β8对TGF-β1活化的调控

将未接受OGD处理的对照组β β8 蛋白表达判 读结果定为1，复氧后各时间点结果以相对于对照 组的倍数来表示。荧光素酶检测结果显示，复氧 后12 h、1 d和2 d的荧光素酶强度分别为对照组 的1.5倍、1.9倍和1.3倍(均P<0.01)，其活性 增高趋势与复氧后各时间点星形胶质细胞β 8 蛋白 表达趋势相似。阻断TGF-β1后，对照组及各时间 点荧光素酶的强度分别下降87％、84％、76％和 75％(均P<0.01)。阻断β 8 后，对照组及各时间 点荧光素酶的强度分别下降63％、57％、65％和 60％(均P<0.01)。以上结果提示星形胶质细胞 表达的β 8 与TGF-β1的活化有关。见图 3。

图 3 星形胶质细胞/TMLC共培养体系中荧光素酶强度 (n=5) a：与对照组β 8 +/+ 比较，P<0.01；b：与同组β 8 +/+ 比较， P<0.01。

3 讨论

整合素α v β 8 是主要的细胞表面受体之一，并 且在CNS中仅与α v 亚基结合形成异二聚体 [9] ，因 此本实验中检测β 8 亚基表达即代表整合素α v β 8 水 平。体内实验发现，β 8 在海马区的免疫活性最强， 主要分布于海马CA3区的透明层、起始层和辐射 层，CA1区的起始层和辐射层，齿状回的分子层 和颗粒细胞层 [5] 。β 8 的这种特异性组织分布，提 示其可能在CNS中有着特殊的调控作用。现有对 β 8 的研究大都是针对其在胚胎期对血管发育的作 用 [10] ，然而对其在CNS损伤后，尤其是HIBD后是否参与损伤后修复过程，目前研究甚少。

β 8 在体外原代培养的鼠胶质细胞和人胶质瘤 细胞中亦被证实是高表达的整合素亚基之一 [10] 。 但是，在CNS HI后，β 8 的表达是否会被诱导性表 达增高，从而参与损伤后的一系列信号通路？本 研究发现，β 8 主要分布于星形胶质细胞的胞浆和 树突。OGD后，β 8 表达在星形胶质细胞中明显增高， 复氧后约1 d其表达达到高峰，其后缓慢降低，至 复氧后2 d仍维持在较高水平。

本课题组既往研究已利用慢病毒载体成功构 建了β 8 RNA干扰系统 [6] 。利用该系统特异性干扰 星形胶质细胞经β 8 表达，干扰后2 d达到最大抑 制率，其β 8 蛋白的抑制率可高达84%，该抑制作 用至少可持续3 d，因此本研究选择实验周期为 3 d以内，从而保证RNA干扰对β 8 表达的抑制作用。

正常情况下，TGF-β1在体内与潜伏相关蛋白 LAP-β1结合，形成潜伏态TGF-β1，必须通过激活 才能发挥其生物学效应。研究表明，TGF-β1活化 通过蛋白水解途径和非蛋白水解途径两条通路进 行 [11] 。星形胶质细胞表达的α v β 8 是潜伏态TGF-β1 的主要细胞表面受体，在体外培养的星形胶质细 胞和新鲜分离的胎脑细胞中，β 8 依赖的TGF-β1活 化亦被证实是CNS中主要的TGF-β1活化通路[12]。 本实验结果表明，在OGD和复氧过程中，将星形 胶质细胞与TMLC细胞株共同培养，可明显增高 TMLC的荧光素酶强度，而荧光素酶强度即代表 TGF-β1激活水平。直接抑制星形胶质细胞中β 8 作 用，TGF-β1活性较未阻断前明显下降，提示CNS 中TGF-β1的激活与整合素β 8直接相关。此外， OGD后，TGF-β1活性的增高趋势与星形胶质细胞 β 8 表达增高的趋势一致，而抑制β 8 后在一定程度 上可抑制TGF-β1活性的增强。以上结果提示，β 8 是CNS缺氧缺血后，诱导TGF-β1持续活化的关键 因素之一。

本研究中，抑制β 8 后，TGF-β1活化的抑制率 不超过65%，而直接阻断TGF-β1，其活化抑制率 则可高达87%。造成这种差异的原因可能是由于 除β 8 外，还有其他因素参与了TGF-β1的活化。 研究发现，体外培养的人星形胶质细胞除了表达 α v β 8 外，还大量表达α v β 5 整合素 [13] 。α v β 5 已被证明 可在肿瘤细胞中激活TGF-β1[14]，虽目前尚无证据 表明其在CNS中的类似作用，但仍不可完全除外α v β 5 等因素参与HI后CNS中TGF-β1的活化。

综上，本研究发现发育期大鼠HIBD时，星 形胶质细胞高表达的整合素β 8 在CNS中对TGF-β1 的活化起关键调控作用。α v β 8 /TGF-β1通路可能与 CNS损伤后自身启动的一系列保护性调控直接相关。

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