新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是指各种围产期窒息引起的 部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停所致的新生 儿脑损伤，是引起新生儿死亡及神经系统发育障 碍的主要原因^[1]。临床研究发现 HIE 可使儿童在 学龄期或青春期出现一系列的行为认知障碍^[2]，其 中行为障碍分为记忆缺失及多动行为改变，后者 包括焦虑冲动行为 / 焦虑样行为改变^[3]，动物研究 已证实初生时缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）可导致大鼠在青春期的焦虑 样多动行为能力低于正常大鼠^[4]。

多巴胺（dopamine, DA）是中枢神经系统的 一种重要神经递质，主要存在于黑质（substantia nigra, SN）和纹状体中，酪氨酸羟化酶（tyroxine hydroxylase, TH）是 DA 合成中关键性的限速酶， TH 的表达可以反映多巴胺能神经元的功能 ^[5]。有 研究显示大鼠的多动样行为改变与 SN 中的 DA 水 平的异常相关联^[6]。本课题前期研究表明 HIBD 可 导致新生 Sprague-Dawley（SD）大鼠在 14~28 d 期 间 TH 在 SN 的表达减少^[7]，但对于 HIBD 后大鼠 青春期焦虑样行为改变是否与 DA 水平的改变存在 关联尚无证据。本研究应用新生大鼠 HIBD 模型， 观察 HIBD 大鼠远期焦虑行为的变化，并通过 DA 受体拮抗剂的干预来探讨 DA 水平的改变对 HIBD 大鼠远期焦虑行为的影响和相关可能机制。 1　材料与方法 1.1　建立新生大鼠 HIBD 模型

健康新生 7 日龄（P7）清洁级 SD 大鼠 120 只， 体重 10~16 g，由中南大学湘雅三医院动物实验部 提供。随机分为正常对照组、假手术组、HIBD 组、 HIBD+DA 受体拮抗剂组 4 组。每组按出生后第 14 天（P14）、第 21 天（P21）和第 28 天（P28）分 为 3 个亚组（n=10）。按照 Rice 法制作 HIBD 模 型，即右侧颈总动脉分离结扎后，置于 8% 氧气和 92% 氮气的混合气体中 2 h；假手术组仅给于右侧 颈总动脉分离，不予结扎和低氧处理；HIBD+DA 受体拮抗剂组在模型制作前 20 min 给予腹腔注 射 D1 受 体 拮 抗 剂 SCH23390（0.5 mg/kg,美 国 Sigama）及 D2 受体拮抗剂 sulpiride（30 mg/kg ,美 国 Sigama），并在制作 HIBD 模型后的 3 h 内，每 小时给予 1 次 SCH23390（0.2 mg/kg）及 sulpiride （3.3 mg/kg）腹腔注射；正常对照组、假手术组及 HIBD 组腹腔注射等量的无菌生理盐水。 1.2　高架十字迷宫实验测定大鼠焦虑行为

分别于 P14、P21 及 P28 对各组采用高架十字 迷宫（elevated plus-maze, EPM）实验进行焦虑行 为测定，EPM 包括两条 50 cm×10 cm×10 cm 相对 开放臂和两条 50 cm×10 cm×40 cm 相对闭合臂， 中央由 10 cm×10 cm 的区域连接，十字迷宫距离 地面 50 cm。测试时室内暗光（以 1.5 m 距离处能 区分大鼠细微活动的最低亮度为准）并保持恒亮， 室温 20℃左右，保持安静。将大鼠从中央区面向 开放臂放入迷宫，观察记录 5 min 内大鼠的活动情 况，指标包括：（1）开放臂进入次数（open arm entry, OE）：进入到任一开放臂的次数，以大鼠 4 个爪子均进入到臂内为准，中途一个爪子从该臂 中完全退出则为该次进入活动完成；（2）闭合臂 进入次数（close arm entry, CE）：进入到任一闭合 臂的次数，以大鼠 4 个爪子均进入到臂内为准， 中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活 动完成；（3）总次数：开放臂和闭合臂的次数之 和（OE+CE），表示大鼠的运动活力；（4）开放 臂停留时间（open arm time, OT）：进入开放臂的 时间；（5）开放臂次数比率（OE%）= OE/ 总次 数 ×100％。每只大鼠测试完毕后用湿布将粪便及 尿液清除，然后再分别用酒精及干布擦拭干净。 1.3　免疫组织化学测定大鼠黑质

TH 的表达 实验动物分别于 P14、P21、P28 经麻醉、心 脏灌注、断头取脑，脑组织固定、脱水、包埋后， 从脑冠状切面自额叶进行连续切片，切至黑质部 位，切片厚度为 5 µm，每只大鼠取 5 张切片。石 蜡切片经脱蜡、水化及抗原修复后，经 3% 过氧化 氢室温去除内源性过氧化物酶，封闭缓冲液（10% 马血清 +0.2% Triton）封闭，一抗（1 : 500 小鼠抗 大鼠 TH 单克隆抗体，美国 Chemicon）、二抗（1 : 400 马 抗 小 鼠 IgG 抗 体，美 国 Vector） 及 ABC 试 剂 （1 : 200，美国 Vector）孵育后，予 DAB 显色剂显 色，镜下控制反应时间后予常规脱水、透明及封 片。用 Image Pro Plus 图像分析软件（美国 Media Cybernetics）分析得出积分光密度（integral optical density, IOD）及测量面积区域（area），再算出平 均光密度（平均光密度 = IOD/area）进行定量分析， 每张切片随机取 3 个视野后取平均值。 1.4　统计学分析

采用 SPSS 18.0 统计软件对数据进行统计学分 析。正态分布的数据以均数 ± 标准差（x±s）表示， 多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较 采用 LSD-t检验。偏态分布数据采用 Kruskal walls test 多重比较秩和检验，组间两两比较采用 Mann Whitney U检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　EPM 测定结果

P14时各组间OT 比较差异无统计学意义 （χ 2=4.84，P=0.19）；P21 时各组间 OT 比较差异 有统计学意义（χ 2=8.25，P=0.04），其中 HIBD 组 OT 较正常对照组（Z=-2.12，P=0.03）、假手术 组（Z=-2.42，P=0.02）及 HIBD+DA 受体拮抗剂 组（Z=-2.04，P=0.04）增高，余组间差异无统计 学意义；P28 时各组间 OT 比较差异有统计学意义 （χ 2=18.83，P<0.01），其 中 HIBD 组 OT 较 正 常 对照组（Z=-3.70，P<0.01）、假手术组（Z=-3.33， P<0.01）及 HIBD+DA 受体拮抗剂组（Z=-2.04， P=0.04）增高，HIBD+DA 受体拮抗剂组较正常对 照组增高（Z=-2.08，P=0.04），余组间差异无统 计学意义。见图 1。

图 1 不同日龄各组开放臂停留时间比较（n=10） a 示与对照组比较，P<0.05；b 示与假手术组比较，P<0.05；c 示 与 HIBD 组比较；P<0.05。

P14 时各组间 OE% 比较差异无统计学意义 （χ 2=4.14，P=0.25）；P21 时各组间 OE% 比较差 异有统计学意义（χ 2=11.65，P=0.01），其中 HIBD 组 OE% 较正常对照组（Z=-2.03，P=0.04）、假手 术组（Z=-2.71，P<0.01）及 HIBD+DA 受体拮抗 剂组（Z=-2.79，P<0.01）增高，余组间差异无统 计学意义；P28 时各组间 OE% 比较差异有统计学 意义（χ 2=16.31，P<0.01），其中 HIBD 组 OE% 较 正常对照组（Z=-3.36，P<0.01）、假手术组（Z=-6.61， P<0.01）及 HIBD+DA 受体拮抗剂组（Z=-2.55， P=0.01）增高，余组间差异无统计学意义。见图 2。

图 2 不同日龄各组开放臂次数比率比较（n=10） a 示与正常对照组比较，P<0.05；b 示与假手术组比较，P<0.05； c 示与 HIBD 组比较，P<0.05。

P14（χ 2=5.73，P=0.12）、P21（χ 2=1.17， P=0.75）及 P28（χ 2=4.72，P=0.19）时各组间总次 数比较差异均无统计学意义，见图 3。

图 3 不同日龄各组总次数比较（n=10）

各组 P14、P21、P28 黑质 TH 平均光密度比 较差异均有统计学意义（F=18.84、11.39、15.20， 均P<0.01），其中 HIBD 组及 HIBD+DA 受体拮抗 剂组在各时间点 TH 水平均低于正常对照组及假 手术组，且 HIBD 组低于 HIBD+DA 受体拮抗剂组 （P<0.05），见表 1，图 4。

表 1(Table 1)

表 1 各组黑质 TH 水平比较　（x±s，n=10）

表 1 各组黑质 TH 水平比较　（x±s，n=10）

图 4 各组各时间点黑质 TH 免疫组化染色（DAB 显色，×400） TH 阳性反应物分布在细胞质，染色呈棕黄色。 HIBD 组在 P14、P21、P28 时的黑质 TH 染色细胞数量较正常对照组及假手术组减少，HIBD+DA 受体拮抗剂组在 P14、P21、 P28 时的黑质 TH 染色细胞数量较 HIBD 组有所增加，但仍低于正常对照组及假手术组。

EPM 是众多焦虑动物模型评价中较为成熟的 经典方法，其原理是利用大鼠对未知新环境喜好 探究的特性，当其处于高悬开臂后又会形成恐惧 的心理，造成矛盾的心理应激，模拟焦虑样症状。 大鼠对高悬而空旷的开放臂的选择偏好与其焦虑 程度呈负相关，即在开放臂的时间延长、次数增 多提示大鼠焦虑程度降低。抗焦虑药物能抑制开 放臂的回避，增加开放臂的次数和时间，而总次 数可以反映动物的运动活性。7 日龄 SD 大鼠脑组 织结构与 32~34 孕周龄的人脑类似^[8] ，21~28 d SD 大鼠则接近成年期，因此 14~28 d 常被用于研究 SD 大鼠动物的青春期行为问题 ^[9]。本研究通过对 7 日龄新生 SD 大鼠进行 HIBD 造模，在 P14、P21 及 P28 观察其焦虑行为，结果显示 P14 时各组比 较各指标均无统计学差异，而 P21 及 P28 时 HIBD 组的 OT 及 OE％较正常对照组和假手术组增加， 提示新生期的 HIBD 能使大鼠的青春期焦虑行为降 低。P14 时各组指标比较差异无统计学意义，主要 原因是大鼠的活力较弱，不能进行有效的来回活 动所致。在 P21 及 P28 时各组的总活力无统计学 差异，可排除了 HIBD 组的焦虑行为降低是由于 其活动力减弱所造成的。在 HIBD 造模前及造模中 腹腔注射 D1 及 D2 受体拮抗剂后，结果示使用了 DA 受体拮抗剂后的 SD 大鼠在 P21 及 P28 的 OT 及 OE% 较 HIBD 组减少，提示了 DA 受体拮抗剂 能改善 HIBD 损伤后 SD 大鼠青春期的焦虑样行为。

DA 是儿茶酚胺类神经递质，TH 是合成多巴 胺的限速酶，抑制或提高该酶的活性可大幅度影 响 DA 的合成，TH 的免疫组织化学常被用于显示 DA 能神经元的胞体和突触 ^[10]。中脑黑质是 DA 能 神经元较为集中的区域^[11] 。本研究结果显示 HIBD 组的黑质 TH 表达较正常对照组及假手术组减少， 提示 HIBD 能导致多巴胺神经元的减少，使用了 DA 受体拮抗剂后的 SD 大鼠在 P14、P21 及 P28 均 比 HIBD 组表达的高，但低于正常对照组和假手术 组，显示了 DA 受体拮抗剂能减轻 HIBD 对脑神经 元的损伤。

有研究表明黑质纹状体处的 DA 能神经元对 脑缺氧缺血表现出易感性^[9]，在脑缺血模型中摧毁 单侧的 DA 能神经元黑质通路后纹状体坏死体积明 显减少。细胞外 DA 主要通过其受体发挥作用，根 据其生化和药理性质，可分为 D1 类受体和 D2 类 受体，D1 类受体包括 D1 和 D5 受体，D2 类受体 包括 D2、D3 和 D4 受体^[12]。大量实验数据证明了 D1 受体拮抗剂 SCH23390 具有抗脑缺血的损伤作 用，其机制主要为脑缺氧缺血时细胞外液大量的 DA 通过突触后膜 D1 受体激活了 cAMP 瀑布反应， 最终导致细胞内钙超载，使神经元损伤。赵菁等^[13] 研究表明了 D2 受体介导了脑缺血时多巴胺的神经 毒性作用，而使用 D2 受体拮抗剂具有神经保护作 用。本研究在 HIBD 前使用 D1 和 D2 受体拮抗剂， 阻断 DA 与其受体发生作用，结果表明了 DA 受体 拮抗剂具有神经保护作用，其机制可能为 DA 受体 拮抗剂阻断了受体介导的钙超载，减轻缺氧缺血 性损伤，降低神经功能的受损程度。

目前 D1 及 D2 受体对焦虑行为的影响还未明 确^[14,15]。本研究发现 HIBD+DA 受体拮抗剂组比 HIBD 组在其青春期的焦虑行为有所增加，提示多 巴胺水平的变化与 HIBD 对青春期焦虑行为的改变 有关，其可能机制为在新生期时应用 DAR 拮抗剂 能减轻 HIBD 对 DA 能神经元的损伤作用，DA 能 神经元损伤较 HIBD 组轻，使其在青春期释放的 DA 较 HIBD 组多，因 DA 的释放的增加与焦虑行 为有关，导致该组在 HIBD 对青春期焦虑行为恢复 到正常水平。

综合以上所得，HIBD 后大鼠青春期焦虑样行 为的变化与多巴胺能神经元损伤有关，初生时给 予 DA 受体拮抗剂能改善 HIDB 对青春期焦虑样行 为的异常作用，提示多巴胺水平的变化与 HIBD 对 青春期焦虑行为的改变有关，但具体相关机制尚 不清楚，需进一步研究为 HIE 的治疗提供一定的 实验室依据。