宫内生长受限（intrauterine growth retardation, IUGR）易发生营养程序化，影响生后能量代谢及 体格生长^[1]。部分由下丘脑神经元所分泌的神经肽 如神经肽 Y（neuropeptidey, NYP），阿片促黑色素 原（proopiomelnacortin, POMC）等在摄食和能量平 衡的调节中发挥着十分重要的作用。Nesfatin-1是 由核组蛋白 2（nucleobindin2, NUCB2）编码的脑肠 肽，与 ghrelin 均是近年来在大鼠中枢及外周发现 的脑肠肽，具有调节摄食及能量代谢等神经内分 泌作用^[2,3]。本课题组既往研究发现，在 IUGR 新 生儿生后早期血浆 nesfatin-1 与 ghrelin 水平均较高， 且与能量代谢及追赶生长有关^[4,5]。国外学者研究 发现 SD 大鼠生后第 1 天血清 nesfatin-1/NUCB2 水 平低于成年大鼠，随日龄增长于生后 13 d、20 d、 27 d 逐渐增高 ^[6]。但它们在 IUGR 患儿中枢及外周 组织的作用以及两者之间的关系目前在国内外未 见报道。

本 研 究 应 用 实 时 荧 光 定 量 PCR（real timePCR） 技 术 及 Western-blot 法 测 定 IUGR 的 SD 大鼠在生后不同日龄及追赶生长情况下胃黏膜 的 nesfatin-1/NUCB2、ghrelin mRNA 及 蛋 白 的 表 达，探讨不同生长情况下IUGR 大鼠外周组织 nesfatin-1/NUCB2、ghrelin 的表达变化及其与生长 的关系。 1　材料与方法 1.1　动物模型的建立

根据文献报道^[7]，采用母鼠妊娠期低蛋白饮 食法，使其自然分娩建立 IUGR 新生大鼠模型。 选取 2 月龄清洁级的未曾交配的成年雌性 SD 大鼠 24 只与雄性 SD 大鼠 12 只（购于河北医科大学实 验动物中心），体重 200~250 g。适应性喂养 1 周 后，随机选择雌雄大鼠按 2 : 1 比例合笼，次日母 鼠阴道涂片找到精子为受孕第 1 天。限食母鼠（怀 孕期间限制蛋白进食，饲料中蛋白含量占 8%）所 生新生鼠出生体重和（或）身长小于正常对照组 新生鼠 2 个标准差者纳入实验组（IUGR 组，R 组）； 同时设自由进食的母鼠（任意摄取标准鼠食，蛋 白含量为 20%）自然分娩后的新生鼠为对照组（C 组）。为防止胎数不均对仔鼠出生体重及生后摄 食等的影响，凡妊娠成活胎仔鼠数不足 5 只或超 过 10 只者，均弃去。

所有仔鼠出生后均由原母鼠母乳喂养，C 组 仔鼠的母鼠分娩后仍自由进食，仔鼠作为对照组 （CC 组，40 只）；R 组仔鼠分为 2 组：1 组为母 鼠分娩后改为自由进食（RC 组，追赶生长组， 40 只），1 组母鼠分娩后继续限食（RR 组，无追 赶生长组，40 只），每周测体重、身长（鼻肛长）。 所有仔鼠 21 d 断乳，给予常规饲料自由进食至生 后 28 d。 1.2　标本留取

RR 组、RC 组及 CC 组仔鼠分别于生后 0 d、 12 d、21 d、28 d（各 10 只）禁食 12 h，10% 水合 氯醛（3 mL/kg）麻醉成功后开腹，腹主动脉取血 并处死，于无菌冰块上迅速分离出胃，沿胃大弯 剪开，剪取胃体部组织 30~50 mg，立即剪碎，无 菌密封，置于液氮罐中速冻，后移至 -70℃深冻冰 箱保存。 1.3　提取RNA及实时荧光定量RT-PCR 法测 nesfatin-1/NUCB2、ghrelin mRNA 的表达

在无RNA酶的环境下制备组织匀浆， 并加入变性液经酸酚- 氯仿将RNA抽提至水 相，与DNA和蛋白质分离，经异丙醇沉淀回 收总RNA，经RNA的纯度及完整性检测，表 明提取的 RNA 蛋白污染很少，进行反转录（试 剂 盒 : Promega，USA）。PCR 扩 增，GAPDH 为内参基因，扩增片段长度120 bp，上游引物：5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游 引 物：5'-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3'；Ghrelin 扩 增 片 段 长 度 136 bp，上 游 引 物：5'-GCCCAGCAGAGAAAGGAAT-3'，下游引 物：5'-AGGGAGCATTGAACCTGATT-3'；Nesfatin-1扩增片段长度116 bp，上游引物：5'-CCAGACACGGGACTTTATTATG-3'，下游引物：5'-CCGCTCCTTATCTCCTCTATG-3'。扩增完毕后， 进入 ABI 7300 型荧光定量 PCR 仪自带的 SDS v1.3 软件的结果分析界面，设置 GAPDH 为内参照基 因，设置基线为 3~15 个循环，得到各样本、各基 因扩增的 Ct 值。设置 B4 样品为标准 1，按照 RQ= 2 ^-△△Ct公式得到各目的基因在各样本中表达水平 的相对定量值（RQ 值），将 RQ 值用于统计分析。 1.4　Western blot 法 测 定 nesfatin-1/NUCB2、 ghrelin 蛋白表达

将胃组织剪碎后置于匀浆套管中，按照 每 100 mg 组 织 1 mL 的 量 加 入 RIPA 裂 解 液 （150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8， 0.1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，0.1% EDTA） 进行匀浆。然后冰浴反应 30 min；离心 取上清 （即蛋白提取液 ），加入 PMSF 调至终 浓度为 1 %，-20℃ 保存。取 1 cm 光径比色杯， 根据考马斯亮蓝试剂盒说明书，用分光光度计于 595 nm 处测定样品 OD 值，按照以下公式计算出 样品的浓度（g/L）：样品浓度 =（样品 OD 值 -空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标 准品浓度 × 样品稀释倍数。在制作的电泳胶板加 样孔中加样，每孔中加入含 50 µg 蛋白的蛋白样品 电泳加样液进行 SDS-PAGE 电泳。转膜、封闭后 加小鼠抗大鼠一抗，4℃过夜。TTBS 振荡冲洗 3 遍， 加入用 TTBS 1 : 3 000 稀释的兔抗小鼠二抗，4℃孵 育 1 h。用 TTBS 室温洗膜 3 次，TBS（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl） 洗 膜 1 次。 抗体结合区带用化学发光法检测。将 DAB 显色的 PVDF 膜在凝胶成像仪上照像，Quantity One 软件 分析。结果用样品与 GAPDH 的 IOD 比值表示。 1.5　统计学分析

采用 SAS 8.0 统计分析软件包对数据进行分 析。所有计量资料用均数±标准差（x±s）表 示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采 用 SNK-q检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组仔鼠生后体重、身长增长比较

出生当天，R 组仔鼠体重及身长明显低于 C 组，RC 组于生后 12 d 内显示出明显的追赶生长， 体重与身长在生后 12 d、21 d 及 28 d 与 CC 组比 较差异均无统计学意义。RR 组于生后 12 d、21 d 及 28 d 体重与身长始终低于 RC 组及 CC 组 （均 P<0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组不同日龄仔鼠体重与身长比较（x±s）

表 1 各组不同日龄仔鼠体重与身长比较（x±s）

大鼠出生后胃黏膜即有nesfatin-1/NUCB2 mRNA 及蛋白的表达。随日龄增长，3 组仔鼠胃 nesfatin-1/NUCB2 mRNA 及 蛋 白 的 表 达 均 明 显 升 高，至生后 28 d，是出生时的数十倍甚至上百倍 （均P<0.01）。断奶前，RC 组均高于 CC 组（均 P<0.01），而断奶后 RC 组与 CC 组无差异。RR 组 在生后各时间点始终低于 RC 组（均P<0.01）。见 表 2,3 和图 1,2。

表 2(Table 2)

表 2 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 nesfantin-1/NUCB2 mRNA 表达（x±s）

表 2 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 nesfantin-1/NUCB2 mRNA 表达（x±s）

表 3(Table 3)

表 3 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 nesfantin-1/NUCB2 蛋白表达（x±s）

表 3 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 nesfantin-1/NUCB2 蛋白表达（x±s）

图 1 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 nesfantin-1/NUCB2 mRNA 表达（n=10） a 示与同日龄 CC 组比较，P<0.01； b示与同日龄RC组比较，P<0.01；c 示 与 同 组 0 d 比 较， P<0.01；d 示与同组 12 d 比较，P<0.01；e 示与同组 21 d 比较， P<0.01。

图 2 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 nesfantin-1/NUCB2 蛋白表达（n=10） a 示与同日龄 CC 组比较，P<0.01； b示与同日龄RC组比较，P<0.01；c 示 与 同 组 0 d 比 较， P<0.01；d 示与同组 12 d 比较，P<0.01；e 示与同组 21 d 比较， P<0.01。

生后当天 ghrelin mRNA 及蛋白在 3 组仔鼠 胃黏膜表达无差异，但生后12 d 开始RC 组高 于 CC 组（均P<0.01），断奶后两组无差异。RR 组于生后 12 d 开始始终低于 RC 组及 CC 组（均 P<0.01）。见表 4,5和图 3,4。

表 4(Table 4)

表 4 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 ghrelin mRNA 表达（x±s）

表 4 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 ghrelin mRNA 表达（x±s）

表 5(Table 5)

表 5 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 ghrelin 蛋白表达（x±s）

表 5 各组不同日龄仔鼠胃黏膜 ghrelin 蛋白表达（x±s）

图 3 各组仔鼠不同日龄胃黏膜 ghrelin mRNA 表达 （n=10） a 示与同日龄 CC 组比较，P<0.01；b 示与同日龄 RC 组比较，P<0.01；c 示与同组0 d 比较，P<0.01；d 示与同组12 d 比较， P<0.01；e 示与同组 21 d 比较，P<0.01。

图 4 各组仔鼠不同日龄胃黏膜ghrelin 蛋白表达 （n=10） 　a 示与同日龄 CC 组比较，P<0.01；b 示与同日龄 RC 组比较，P<0.01；c 示与同组0 d 比较，P<0.01；d 示与同组12 d 比较， P<0.01；e 示与同组 21 d 比较，P<0.01。

研究表明，无论中枢还是外周注射 nesfatin-1 均有很明显的抑制摄食的作用^[8,9]。而脑室内注射 nesfatin-1 抗体可刺激摄食 ^[2] 。禁食后胃内 NUCB2 mRNA 表达下降，同时血浆 nesfatin-1/ NUCB2 水 平下降，再投喂后可恢复^[10] 。因此证实 nesfatin-1 作为抑制摄食的调节肽在下丘脑和外周均发挥重 要作用。

Nesfatin-1 免疫阳性细胞主要分布在胃的下 1/2 到 1/3 处，此处的内分泌细胞最多，包括分泌 ghrelin 的 X/A 样细胞 ^[11,12]。本研究检测胃黏膜内 nesfatin-1 与 ghrelin 的 mRNA 及蛋白的表达，发现 大鼠出生后胃黏膜即有 nesfatin-1 mRNA 及蛋白的 表达，且随日龄增长而增加，与国外学者研究一 致^[6,13] 。断奶前，RC 组胃黏膜 nesfatin-1 的表达高 于 CC 组，而断奶后 RC 组与 CC 组表达无差异。 RR 组始终低于 RC 组，提示 nesfatin-1在3组之间 的差异与追赶生长关系密切。nesfatin-1在RC组 胃内的高表达可能是对 RC 组食欲良好、体重增加 的一种适应性反应。RC 组体重增长较快，升高的 nesfatin-1 可能有利于防止其食欲过盛及体重过度 增长而导致肥胖。相反，RR 组胃内 nesfatin-1的 低表达可能有利于其提高食欲及体重增加。

既往研究显示，高脂喂养的肥胖小鼠 ghrelin 在胃肠道表达下调，血浆 ghrelin 水平降低，而进 食后血浆中水平升高^[14,15]。杨慧明等^[16] 研究认为 ghrelin 可能参与了宫内 IUGR 胎鼠的生理调节或病 理过程。本研究结果显示，ghrelin 与 nesfatin-1共 同表达于胃黏膜。生后当天 ghrelin mRNA 及蛋白 在 3 组仔鼠胃黏膜表达无差异，但生后 12 d 开始 RC 组高于 CC 组，断奶后两组无差异。RR 组于 12 d 后始终低于 RC 组及 CC 组。与既往研究结果 一致^[13,17]。提示 ghrelin 参与了 IUGR 仔鼠生后早 期的营养调控。Ghrelin 与 nesfatin-1 在胃内的表达 变化趋势一致，提示 nesfatin-1 和 ghrelin 作为脑肠 肽相互作用，相互协调，在摄食及能量代谢中发 挥重要作用。两者之间的相互作用尚需进一步深 入研究。