先天性心脏病（congenital heart disease, CHD） 的发病率约为 6‰ ~8‰^[1]。根据我国 2012 年出生 缺陷防治报告资料，从 2005 年起，CHD 已跃居 我国出生缺陷首位，占所有出生缺陷监测病例的 26.7%（2011 年），是新生儿和婴儿期致残、致死 的重要原因^[2]。目前 CHD 发病率整体呈上升趋势， 据估算我国每年新增 CHD 患儿将超过 13 万例。 目前对于 CHD 发病机制的研究主要集中在心脏发 育分子调控领域，其中小分子 RNA（mircoRNAs, miRNAs）作为近年来发现的一种表观遗传调控机 制，已经成为发育生物学的研究热点。

miRNAs 是一类在转录后水平调控基因表达的 小分子非编码 RNA，大小约为 22 个核苷酸。调控 方式主要通过靶向结合 mRNA，进而抑制或阻断 翻译^[3,4]。在心血管系统疾病中，通过 miRNAs 表 达谱分析可以检测到多种 miRNAs 表达变化^[5]，它 们在心力衰竭、心律失常、心肌肥厚和心脏发育 等心血管疾病的发生演变及相关生物过程中起着 重要的调控作用^[6,7,8,9,10]。

现阶段关于 miRNAs 在 CHD 中的研究可以分 为临床和动物研究两类，临床研究因取材于手术 或流产标本，其研究结果更具有代表性和应用价 值；动物实验研究因操作性更强，能进行更深入 的基因敲除和信号通路研究。本文就这两方面的 研究进展做一综述。 1　miRNAs 的结构与生物合成

miRNAs 是一类约为22 个核苷酸长度的具 有调控功能的非编码 RNA，其生物合成过程至 今尚未完全阐明。多数观点认为， miRNAs 基因 在 RNA 聚合酶Ⅱ、Ⅲ的作用下转录得到转录初 产 物（primary miRNA, pri-miRNA），pri-miRNA 在 RNA 聚合酶Ⅲ Drosha ^[11] 和 DiGeorge 综合征关 键 区 域 8 蛋 白（DiGeogre syndrome critical region 8，DGCR8） ^[12,13] 的协同催化下被剪切成60~70 个核苷酸长度的茎环状 miRNA 前体（precursor miRNA，pre-miRNA） ^[3,4] 。随后 pre-miRNA 被 RanGTP 依赖的 Exportin-5 转运体识别并从细胞核内转 运至胞浆，最终在胞浆中被 RNA 聚合酶Ⅲ Dicer 和 反 式 激 活 应 答 RNA 结 合 蛋 白（transactivating response RNA-binding protein, TRBP）剪切成含约 22 个核苷酸的具有基因沉默功能的成熟双链结 构^[14,15]。 2　miRNAs 的调控机制与功能

成熟双链结构中的主导链（guide strand） 由 Argonaute 蛋白识别，并与 RNA 诱导转录沉默复合 物（RNA-induced silencing complex, RISC）结合， 形 成 miRISC，而 miRNAs 的 随 从 链（passenger strand）被迅速降解 ^[4]。miRISC 与 mRNA 的 3' 非 编码区（3' untranslated regions, UTRs）结合后可致 基因沉默，基因沉默的效果取决于 miRNAs 与靶基 因之间的互补程度，当二者互补不完全时仅抑制 翻译水平，完全互补时则会导致相应 mRNA 发生 降解^[3,4]。

目前研究证实 miRNAs 在心肌细胞的增殖、 分化和凋亡、心脏神经嵴细胞的迁移、心脏形态发 生和心脏图式发育等诸多过程中起重要作用^[9,16,17]。 miRNAs 具有功能丰余性（functional redundancy） 和上位联系性（epistatic relationships） ^[18]，即一个 miRNA 可能有多个基因靶点、多个 miRNAs 也可 以共同调控一个基因靶点^[19]，故寻找其上下游靶 点及相关通路非常复杂，其实验设计及实施需十 分缜密。 3　miRNAs 与先天性心脏病

多数观点认为，心脏发育是一个多基因时空 调控的过程，实验研究证实 miRNAs 可参与心脏发 育的相关通路调控进而导致 CHD 发生^[20]。

目前，miRNAs 在 CHD 发生机制中的研究可 分为临床及动物研究两类。因 miRNAs 在物种间具 有保守性，利于动物实验及临床研究结果进行比较 并相互促进；同时，miRNAs 还具有组织和发育阶 段特异性，如 miR-1 和 miR-133 在心肌和骨骼肌特 异性表达，并主要在新生和成年小鼠中表达^[21]， 利于研究特定组织细胞发育（如心脏发育组织） 的基因调控。 3.1　临床研究

miRNAs 的临床研究标本来源于 CHD 患儿手 术心脏标本或流产胎儿的心脏标本。

室间隔缺损（ventricular septal defect, VSD）是 最常见的 CHD 类型。Li 等^[22] 发现与对照组儿童 相比，VSD 患儿心脏组织中 miRNAs 有显著变化， qRT-PCR 实 验 证 实 miR-1-1表达下调，而miR-181c 表达上调。Li 等 ^[22] 筛选并证实了 miR-1-1的 两个靶基因—GJA1 和 SOX9。SOX9 是心脏瓣膜和 间隔发育重要的调控基因，在心内膜垫的形成中 具有重要作用^[23]。人类家系研究发现，SOX9 上游 区的增强子（如 Nkx2.5 和 Gata4）失调，与 CHD 发生有着重要关系^[24] 。GJA1 基因编码连接蛋白 43 （Cx43），是主要的心脏缝隙连接通道。在大鼠 心肌梗死模型上，心肌 miR-1 的过表达可抑制靶 基因 GJA1 和 KCNJ2，引起 QRS 波增宽、QT 间期 延长等心律失常^[25] ，而 miR-1 调控 GJA1 与 VSD 发生之间的关系还有待进一步阐明。Li 等^[22] 还发 现，miR-181c 的 靶 基 因 是 BMPR2，BMPR2 基 因 编码骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）2 型受体。Beppu 等 ^[26] 在小鼠中条件性基因 敲除 BMPR2，导致右心室双出口、VSD 和心内膜 垫缺损等心血管畸形。BMP2 及其受体是心脏发育 中间隔形成、瓣膜生成、房室管形态发生以及心 内膜垫上皮间质转化等过程所必需的^[26,27]。

法洛四联症（tetralogy of Fallot, TOF）是存活 婴儿中最常见的青紫型 CHD。O'Brien 等^[28] 发现， 与配对婴儿相比，TOF 患儿中共有 61 个 miRNA 显 著 变 化， qRT-PCR 验 证 显 示 miR-1275、miR-27b 和 miR-421 表达上调，而 miR-1201 和 miR-122 表达下调。miR-27b 过度表达可抑制靶基因 Mef2c 影响心脏发育中心肌生成过程（myogenesis），导 致心肌肥厚^[29] 。研究显示，miR-27b 在心肌中的靶 点为过氧化物酶体增生物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ）， PPAR-γ 抑制与心肌肥厚直接相关^[30] ；miR-122 在 转基因模型小鼠（Pax-8 ^-/- mice）上的过表达可引 起左室壁和间隔区的细胞凋亡，导致 VSD 发生^[31]。

然而，miRNA 表达具有时空差异性，取材于 出生后心脏标本的研究结果能否反映胚胎时期的 特征尚存在争议。与其他研究者不同的是，O'Brien 等^[28] 收集了妊娠 90 d 的胎儿心脏标本作为研究 TOF 的胚胎学对照，发现只有 miR-1275、miR-421 和 miR-1201 的表达变化在胎儿期与出生后一致， 而在胎儿标本中，miR-122 表达上调，miR-27b 表 达下调，提示胎儿期与出生后患儿心肌中 miRNAs 的表达变化不尽相同，因此，胎儿期心肌标本或 能为 CHD 胚胎发育机制阐明提供更多的信息。如 果研究仅探讨出生后的疾病状态和进展 [如 TOF 中右心室肥厚的机理，二叶式主动脉瓣（bicuspid aortic valve, BAV）中的钙化机制]，不涉及胚胎发 育成因，则不存在上述胚胎学代表性的疑问，这 种研究是非常有价值的。

Zhang 等 ^[32] 发现，与非配对捐赠心脏对照相 比， TOF 患儿心脏标本中有 47 个表达显著变化 的 miRNAs，其 中 16 个 表 达 下 调，31 个 表 达 上 调。生物学信息方法研究显示，促分裂原活化蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK） 通路相关的 6 个基因（MAPKAPK3、MAPK3K3、 MAPK3K5、MAPK3、MAPK9 和 TRAF2）可能是上 述 miRNAs 的靶点，参与了右心室肥厚的病变^[32]。 有报道显示，与对照组相比，在 CHD 胎儿心脏 标本中 MAPK 通路分子蛋白有明显表达变化^[33]。 Brown 等 ^[34] 发现在缺氧诱导的肺动脉高压小鼠模 型中，MAP3K2 参与了右室心肌肥厚的发生。

BAV 是重要的先天性心脏瓣膜疾病。Nigam 等^[35] 采用 BAV 患者瓣膜标本进行 miRNAs 研究， 发现相对于主动脉瓣关闭不全组，主动脉瓣狭窄 组瓣膜中的 miR-26a、miR-30b 和 miR-195 表达下 调。体外 miRNAs 模拟体（mimic）细胞转染实验 证实 miR-26a 和 miR-30b 能抑制钙化相关通路的 mRNA 水平，miR-195 作用则相反，能使钙化相关 通路的 mRNA 水平提高，如 miR-26a 可抑制前钙 化基因（pro-calcification gene）BMP2，骨形态发生 蛋白-2（BMP2）基因在主动脉狭窄的瓣膜中有过 表达，参与了瓣膜的钙化^[36]。

由于上述 CHD 大多预后良好，即使超声证实 这些 CHD 的存在，医学妊娠决策及孕妇、家庭的 意愿均指向继续妊娠及出生后治疗，因此缺乏这 些疾病胎儿期心脏标本的相关研究报道。然而对 于一些严重的复杂型 CHD，产前明确诊断后，部 分将被终止妊娠，在符合伦理和知情同意的情况 下可以选择这类 CHD 的胎儿心脏标本进行研究。

单心室（single ventricle, SV）是一种预后不 良的严重青紫型 CHD。Yu 等^[37] 发现与对照组相 比，自然流产的胎儿单心室心脏标本中共有 48 个 miRNA 显著变化，其中 qRT-PCR 实验显示 hsamiR-214、hsa-miR-19b 和 hsa-miR-126 表达上调， hsa-miR-200a、hsa-miR-10a 和 hsa-miR-206 表达下 调，这 些 miRNAs 可 能 通 过 WNT 和 mTOR 通 路 参与了单心室心脏发育的调控。Liu 等^[38] 发现， miRNAs 参与了小鼠神经发育中经典WNT 通路 （Wnt-β-catenin signaling）的调控。

目前国内通过手术标本进行 CHD 发生机制实 验研究很大程度上局限于对照组心脏标本的获取。 在Li等^[22] 对 VSD 的研究中，28 例手术实验组只 有 7 例对照，且作者未明确指出对照组的人口学 信息是否配对，研究的难度可见一斑。国外组织 标本库（Tissue Bank for Developmental Disorders） 的建立使这方面的研究具有明显优势。如 Kuhn 等^[39] 从标本库中取唐氏综合症的胎儿标本研究 miRNAs 的作用，发现 5 个人类 21 号染色体衍生 miRNAs（miR-99a、let-7c、miR-125b-2、miR-155 和 miR-802）过表达，这些 miRNAs 可能参与了唐 氏综合症患儿神经和心脏异常发育过程。 3.2　动物实验研究

miRNAs 的临床研究虽然具有代表性，但却 无法阐明与CHD 相关的miRNAs 中每一个具体 miRNA 的功能作用，也不能直接说明这些 miRNA 之间是如何相互作用并如何调控 CHD 的胚胎发育。 而动物实验研究既能直接针对某一 miRNA 在心脏 发育中的作用进行研究，也能获取心脏发育各个 时期 miRNAs 的表达规律并证明其与心脏发育的 相关性。目前基因敲除实验已经证明部分 miRNA 参与心脏发育过程，并且具有一定的表型特异 性，同时采取联合敲除等手段的实施，再次证明 miRNA 调控的复杂性和功能丰余性。

Liu 等 ^[40] 特异性地敲除了小鼠中的miR-133a-1 和 miR-133a-2基因，发现单一敲除miR-133a-1 或 miR-131a-2 的小鼠发育特征及心脏结 构与野生型基本相同，而联合敲除 miR-133a-1与 miR-133a-2 的小鼠约半数在胚胎期或出生早期死 亡，最为常见的心脏畸形为 VSD，其余存活至成 年小鼠也极易进展为扩张型心肌病和心力衰竭。 Liu 等 ^[40] 证实 miR-133a 可能通过 SRF 和 cyclin D2 基因调控心肌细胞增殖和凋亡。Chen 等^[21] 研究发 现 miR-133a-1 和 miR-131a-2 具有相同序列且分别 位于小鼠 18 号染色体和 2 号染色体，它们在调控 小鼠心脏发育中有类似的功能。

在本世纪初，研究者发明了 Cre-loxP 重组系 统条件性基因敲除（conditional gene knock-out）技 术^[41]。利用该项技术可以特异性敲除特定的发育 组织细胞（如心脏神经嵴细胞）中 miRNAs 合成的 必要 RNA 聚合酶Ⅲ Dicer 基因，而不影响其他组 织中的 Dicer 正常表达和 miRNAs 正常合成，这既 减少了广泛基因敲除可能导致的突变型高致死率， 又能证明 miRNA 在特定组织细胞发育中的调控作 用。Huang 等^[17] 运用该技术条件性地敲除神经嵴 细胞系（neural crest cell lineage, NCCs）中的 Dicer 基因，培育出 Dicerflox/flox /Wnt1-Cre 小鼠，发现心脏 神经嵴细胞中丢失 Dcier 后，心脏图示发育受到严 重影响，导致诸如 B 型主动脉弓中断、右心室双 出口、VSD 等多种心血管畸形。上述提及的主要 研究概要见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 先天性心脏病发病机制中 miRNAs 作用的概要

表 1 先天性心脏病发病机制中 miRNAs 作用的概要

miRNAs 的发现为阐释和研究基因表达调控、 生物过程异常调控和疾病发生提供了一个全新的 视角。虽然暂时对于 miRNAs 的生物学功能还知之 甚少，对其在心脏发育和先天性心脏病形成中的 作用也非常局限，但由于具有分子量小、作用特异、 组织细胞特异等优点，决定了 miRNAs 很好的研究 价值和临床应用前景。