肺炎链球菌是人类重要的致病菌，可引起呼 吸道感染、菌血症、脑膜炎等，尤其肺炎仍然是 5 岁以下儿童因感染死亡的重要原因 ^{[ 1 ]}。抗生素 在细菌感染治疗中起到关键作用。但是近年来由 于耐药菌株的出现及迅速传播，给儿童呼吸道感 染的治疗造成了极大困扰。肺炎链球菌结合疫苗 （pneumococcal conjugated vaccine, PCV）上市后， 监测数据表明普遍接种 PCV 可降低肺炎链球菌感 染的疾病负担^{[ 2 ]}。本研究调查北京儿童医院门诊呼 吸道感染儿童鼻咽拭子肺炎链球菌分离状况，并 监测分离株血清型和抗生素耐药性，供临床用药 和疫苗免疫决策时参考。 1　资料与方法 1.1　研究对象及标本采集

研究对象为2013年3月至2014年2月在北 京儿童医院门诊就诊的上呼吸道感染儿童，患儿 均有发热等症状。每天采集标本数为 10~20 例， 共采集了 2 941 份鼻咽拭子标本。患儿年龄为 1 月 龄至 16 岁，其中男 1 741 例，女 1 200 例。标本采 集均经监护人同意。标本采集后立即放入脱脂奶 粉 - 胰蛋白胨 - 葡萄糖 - 甘油（skim milk-tryptoneglucose-glycerol, STGG）转运培养基，2 h 内送至实 验室培养。 1.2　细菌分离、培养和鉴定

将鼻咽拭子标本放入CO2 孵育箱孵育， 35℃，4 h，然后震荡 10~20 s，取 40 μL 液体转种 于 5% 脱纤维羊血 TSA 琼脂（Oxoid，英国）平板上， 35℃ 5%CO2过夜孵育。挑草绿色溶血可疑菌落， optochin 纸片试验和全价血清凝集试验阳性鉴定为 肺炎链球菌^{[ 3 ]}。 1.3　血清分型

随机数字法选择 100 株进行血清分型和抗生 素耐药性检测。使用相差显微镜观察荚膜肿胀反 应进行血清分型。分型血清为肺炎链球菌棋盘式 分型系统（Pneumotest kits）和因子分型血清（Statens Serum Institut，丹麦） ^{[ 4 ]}。本研究能检测出的血清 型为 23 价多糖疫苗包括的型别（1、2、3、4、 5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 型） 和 6A、6C 和 6D 型，其他不能确定的型别暂归为 不能分型。 1.4　抗生素敏感性试验

采用 Etest（AB Biodisk，瑞典）方法检测菌 株对 12 种抗生素的敏感性，包括：青霉素、阿莫 西林 / 棒酸、头孢克洛、头孢呋辛、头孢曲松、亚 胺培南、红霉素、阿奇霉素、四环素、甲氧苄啶 -磺胺甲噁唑、左氧氟沙星和氯霉素。判断标准采 用 CLSI 2012 版 ^{[ 5 ]}。为了与既往研究资料比较，对 口服和胃肠外（非脑膜炎）青霉素两种界值的判 定结果都做了描述。对 3 种或 3 种以上抗生素耐 药定义为多重耐药。 1.5　统计学分析

采用 SPSS 16.0 统计软件进行统计学分析。采 用软件 WHONET 5.3 进行抗菌药物敏感性分析。 计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用χ 2 检验或 Fisher 精确概率法。P<0.05 表示差异有统 计学意义。 2　结果 2.1　携带率

2 941 份鼻咽拭子标本中，分离出肺炎链球菌 699 株，携带率为 23.8%（699/2 941）。肺炎链球 菌携带率高峰出现在 4 月，达 36.6%；此后渐降 低至 8、9 月，最低值 15.7%；以后再逐渐升高， 11、12 月出现第二次分离率高峰，均在 28% 以上。 各个月份的肺炎链球菌分离率见图 1。 不同年龄段上呼吸道感染儿童鼻咽部携带肺 炎链球菌状况见图 2。5 岁及 5 岁以下儿童携带率 均超过 20%，4 岁组儿童携带率最高，为 38.6%， 以后随着年龄增长携带率降低。

图 1 各月上呼吸道感染儿童鼻咽部肺炎链球菌分离率

图 2 不同年龄段上呼吸道感染儿童鼻咽部携带肺炎链球菌状况

100 株肺炎链球菌对青霉素等抗生素的敏感 性试验结果见表 1。所有菌株对阿莫西林 / 棒酸、 左氧氟沙星敏感。菌株对静脉用青霉素敏感率为 98.0%，对口服青霉素敏感率仅 33.0％；青霉素 对菌株的最小抑菌浓度（MIC）50和 MIC90分别 为 0.5 mg/L、2 mg/L。菌株对头孢克洛耐药率达 54.0%，没有菌株耐头孢曲松和亚胺培南，但中介 率分别达到 18.0% 和 38.0%。菌株耐红霉素和阿 奇霉素比率很高，不敏感率均达 97.0%；MIC50和 MIC90均在 256 mg/L 以上。多重耐药率为 86.0%， 71.0% 的菌株同时对大环内酯类、四环素和磺胺类 耐药。

表 1(Table 1)

表 1 100 株肺炎链球菌对青霉素等抗生素的敏感性

表 1 100 株肺炎链球菌对青霉素等抗生素的敏感性

对 100 株肺炎链球菌进行血清型检测显示， 常见血清型为 6A（12 株，12.0%）、19F（12 株， 12.0%）、6B（10 株，10.0%）、23F（9 株，9.0%） 和 14 型（8 株，8.0%）。PCV7（19F、6B、23F、 14、18C、9V 和 4 型）、PCV10（PCV7+1、5 和 7F 型） 和 PCV13（PCV10+6A、19A 和 3 型）覆盖率分别 为 41.0%（41 株）、42.0%（42 株）和 59.0%（59 株）。非 PCV13 覆盖血清型包括 15B（5 株，5.0%）、 6C（4 株，4.0%）、23A（4 株，4.0%）和不能分 型（9 株，9.0%）。23 价荚膜多糖疫苗（PPV23） 覆盖率为 71.0%（71 株）。 2.4　PCV 覆盖菌株与非 PCV 覆盖菌株抗生素不敏感率比较

PCV13 覆盖菌株对口服青霉素、头孢菌素类 和亚胺培南的不敏感率明显高于非 PCV13 覆盖菌 株；PCV7 覆盖株与非 PCV7 覆盖株比较也具有相 似差异（表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 100 PCV 覆盖菌株与非 PCV 覆盖菌株抗生素不敏感率（中介 + 耐药）比较[n（%）]

表 2 100 PCV 覆盖菌株与非 PCV 覆盖菌株抗生素不敏感率（中介 + 耐药）比较[n（%）]

肺炎链球菌常定植于儿童鼻咽部。本研究结 果显示我院门诊上呼吸道感染就诊儿童鼻咽部肺 炎链球菌携带率为 23.8%，明显低于前期本课题组 报告的数据（30%~40%）^{[ 6 ]}，可能主要与以下因素 有关：（1）本研究为 1 整年度的携带率调查研究， 既往研究多是在 11 月至次年 4 月开展。本研究结 果也显示了在不同月份儿童鼻咽部肺炎链球菌分 离率不同。（2）本研究纳入了门诊就诊的 18 岁 以下所有年龄段的儿童，既往研究仅采集 5 岁以 下儿童的标本。此次数据也显示了不同年龄段儿 童肺炎链球菌携带率的差异。4 岁组儿童携带率最 高，可能与该年龄段儿童处在进入托幼机构的初 期有关。

100 株肺炎链球菌中只有 2 株对静脉青霉素 不敏感（MIC 值分别为 3 mg/L 和 6 mg/L），但口 服青霉素不敏感率达 67.0%，明显高于 2000~2002 年的 18.0%~28.7%^{[ 7 ]}，与 2010 年的 55.0% 比较也 升高^{[ 8 ]} 。另外，青霉素对肺炎链球菌的 MIC50和 MIC90分别达 0.5 mg/L 和 2 mg/L，而 2010 年的研 究结果显示两者分别为 0.25 mg/L 和 0.75 mg/L ^{[ 8 ]}， 说明肺炎链球菌对青霉素的耐药性一直处于增强 的过程中。另外，值得注意的是多重耐药率高达 86.0%，与既往研究 ^{[ 7, 8 ]}相符。有的国家肺炎链球 菌多重耐药则较为少见，如俄罗斯只有 22%^{[ 9 ]}。

本研究显示肺炎链球菌常见血清型为6A （12%）、19F（12%）、6B（10%）、23F（9%） 和14 型（8%），常见血清型基本符合本地区 2000 年以后的研究报告 ^{[ 10 ]}，但具体比例有所不同。 本研究中 PCV7、PCV10 和 PCV13 3 种结合疫苗覆 盖率分别为 41.0%、42.0% 和 59.0%，与 2010 年 北京儿童医院 140 株鼻咽携带肺炎链球菌 3 种疫 苗的覆盖率（分别为 43.6%、43.6% 和 60.0%）^{[ 9 ]} 吻合。既往研究显示，我国北方地区（如北京、 天津和沈阳）PCV7 覆盖率明显低于东南部城市（如 上海、广州和深圳）^{[ 10, 11 ]}。因此，全国多中心研 究报告的疫苗覆盖率较本研究结果高。2006~2008 年北京儿童医院与全国 11 家儿童医院合作，收集 到 171 株侵袭性肺炎链球菌感染（IPD）的菌株， 第 16 卷 第 10 期 2014 年 10 月 中国当代儿科杂志 Chin J Contemp Pediatr Vol.16 No.10 Oct. 2014 ·992· 其 PCV7、PCV10 和 PCV13 覆盖率分别为 60.3%、 66.7% 和 87.8% ^{[ 11 ]}。结合疫苗上市以后，美国在本 土和非洲等地研究计划免疫 PCV 前后住院肺炎链 球菌肺炎的发病率变化，发现疫苗接种后 2 岁以 下儿童中发病减低了 65%，2~4 岁儿童中减低了 73% ^{[ 12, 13 ]}。我国目前 PCV7 接种率非常低，缺乏基 础发病资料，也缺少疫苗接种后相关疾病发病情 况的研究，无法评估疫苗使用效果。但从疫苗覆 盖率来看，PCV13 显然能获得更好的预防效果。

研究表明，接种 PCV 可使免疫人群鼻咽部疫 苗血清型肺炎链球菌携带下降、耐青霉素肺炎链 球菌携带下降和非疫苗型替换。疫苗接种可保护 接种人群，并可阻止病原播散，同时可减少抗生 素使用，减少细菌耐药的发生和扩散^{[ 14 ]}。西班牙 是抗生素消费和肺炎链球菌对抗生素耐药率很高 的国家，1999 年肺炎链球菌对青霉素不敏感率为 33.9%，但其从 2004 年引进 PCV7，2008 年肺炎链 球菌分离株对青霉素的不敏感率下降到22.3% ^{[ 15 ]}。 本研究显示 PCV13 覆盖菌株对口服青霉素、头孢 菌素和亚胺培南不敏感率明显高于非 PCV13 覆盖 菌株，也提示推广计划免疫 PCV 对控制肺炎链球 菌抗生素耐药有积极意义。