中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (1): 1100-1104   PDF    
引用本文
马玉平, 彭镜, 王颖, 陈云, 吴丽文, 尹飞等.60例不明原因早期癫癎性脑病临床特点及全基因组拷贝数变异分析[J]. 中国当代儿科杂志, 2014, 16(11): 1100-1104.  
MA Yu-Ping, PENG Jing, WANG Ying, CHEN Yun, WU Li-Wen, YIN Fei et al. Clinical features and genome-wide copy number variation analysis in 60 children with early-onset epileptic encephalopathies of unknown cause[J]. CJCP, 2014, 16(11): 1100-1104.   
60例不明原因早期癫癎性脑病临床特点及全基因组拷贝数变异分析
马玉平, 彭镜, 王颖, 陈云, 吴丽文, 尹飞     
中南大学湘雅医院儿科/湖南省儿童智力障碍研究中心, 湖南 长沙 410008
收稿日期：2014-3-18
基金项目：国家自然科学基金(81370771);中南大学研究生自主探索创新项目(2013zzts311).
作者简介：马玉平,女,硕士研究生,住院医师.
通讯作者：尹飞,男,教授.
摘要：目的 研究不明原因早期癫癎性脑病(EEEs)患儿临床特点,并进行全基因组拷贝数变异检测,寻找致病性微缺失/重复.方法 收集2012 年7 月至2013 年4 月60 例不明原因EEEs 患儿临床资料进行分析,采集患儿及其父母样本,应用SNP array 技术对患儿进行全基因组拷贝数变异检测,结合荧光原位杂交技术进行验证及父母来源分析,寻找可疑致病性拷贝数变异.结果 60 例不明原因EEEs 患儿诊断婴儿痉挛症34 例,大田原综合征3 例,婴儿严重肌阵挛性癫癎3 例,余20 例分型不明确.77% 患儿伴有中重度智力障碍.颅脑影像学检查提示35% 患儿脑发育不良或脑萎缩.54 例患儿中,17% 有小头畸形.经治疗28 例患儿癫癎控制,16例未控制,5 例死亡,1 例失访.全基因组拷贝数变异分析结果:5 人发现7 个致病性或可疑致病性拷贝数变异.结论 不明原因EEEs 临床表现多样,预后差.全基因组拷贝数变异分析可发现致病性或可疑致病性拷贝数变异,丰富癫癎脑病基因型数据库,促进对不明原因EEEs 病因学的进一步认识,为患者家庭再生育的遗传咨询提供理论依据.
关键词： 早期癫癎性脑病     临床特点     全基因组拷贝数变异     儿童    
Clinical features and genome-wide copy number variation analysis in 60 children with early-onset epileptic encephalopathies of unknown cause
MA Yu-Ping, PENG Jing, WANG Ying, CHEN Yun, WU Li-Wen, YIN Fei     
Department of Pediatrics, Xiangya Hospital of Central South University/Hunan Intellectual and Developmental Disabilities Research Center, Changsha 410008, China
Abstract: Objective To study the clinical features of early-onset epileptic encephalopathies (EEEs) of unknowncause, and to identify pathogenic microdeletion/microduplication of EEEs by genome-wide analysis of copy numbervariations (CNVs). Methods The clinical data of 60 children diagnosed with unexplained EEEs between July 2012 and April 2013 were obtained and analyzed. Specimens were collected from the selected children and their parents.Single nucleotide polymorphism array was used to detect genome-wide CNVs, and fluorescence in situ hybridizationwas performed to verify the results and analyze the source of the parents, further to identify suspected pathogenic CNVsof EEEs. Results Among the 60 children with unexplained EEEs, 34 were diagnosed with West syndrome, 3 withOhtahara syndrome, 3 with Dravet syndrome, and 20 with unclassified EEEs. In total, 77% of the patients were associatedwith moderate to severe mental retardation. Head imaging test implied that 35% of the patients had brain dysplasiaor astrophy. Among 54 patients, 17% showed microcephalus. After treatment, 28 patients had clinical seizures undercontrol, 16 out of control, 5 dead, and 1 lost to follow-up. Genome-wide analysis of CNVs showed that 7 pathogenic orsuspected pathogenic CNVs were present in 5 patients. Conclusions EEEs of unknown cause are associated with highphenotypic heterogeneity and poor prognosis. Genome-wide CNVs analysis can demonstrate pathogenic or suspectedpathogenic CNVs. This research expands the gene bank of EEEs and improves the understanding about possible etiologyof unexplained EEEs. The results provide a reference for genetic counseling regarding reproduction in the patient'sfamily.
Key words: Early-onset epileptic encephalopathies     Clinical feature     Copy number variation     Child    

早期癫癎性脑病（early-onset epileptic encephalopathies,EEEs）是指发生在新生儿或婴儿 早期由反复临床惊厥或发作间期严重癎样放电导 致认知、运动全面落后、重度智力障碍等灾难性 神经系统后遗症的一类综合征[1]。国际抗癫癎联 盟（International League Against Epilepsy,ILAE）确 认的EEEs 包括大田原综合征（Ohtahara syndrome, OS）、婴儿痉挛症（West syndrome,WS）、婴儿 严重肌阵挛癫癎（Dravet syndrome）、早期肌阵挛 脑病、非进展性的肌阵挛脑病和婴儿严重局灶性 游走性癫癎。排除获得性脑损伤、脑结构异常、 遗传代谢性疾病、染色体病及单基因病等原因， 目前仍有半数病因不明。癫癎性脑病是一种遗传 异质性很高的症候群，且临床表型谱宽泛。至今 已明确EEEs 致病基因有18 个，部分基因通过全 基因组拷贝数变异（copy number variations,CNVs） 分析定位，全基因组CNVs 是指与基因组参考序列 相比数百bp 至数Mb 的微缺失/ 微重复[2]。目前 研究较多的是CNVs 与智力障碍、自闭症、精神 分裂症的关系[3]；自2009 年以来，Helbig 等[4] 及 De Kovel 等[5] 发现全面性/ 部分性癫癎及癫癎脑病 与CNVs 密切相关，其中可能与多种全面性及局 灶性癫癎相关的潜在致病性CNVs 包括15q11.2、 16p11.2、6p13.11 等区域中的CNVs；Mefford 等 [6] 于2011 年对315 例癫癎性脑病的患者进行全基 因组CNVs 分析提示，7.9%（25/315） 患者携带 的CNVs 可能与其临床表型相关，并且发现了新 的癫癎性脑病候选基因：CACNA2D1、SLC1A3、 ADAM23。Bedoyan 等[7] 也发现16p11.2 的CNVs 与婴儿严重局灶性游走性癫癎相关；以上研究均 表明CNVs 是导致不明原因EEEs 的重要原因，目 前国内尚未见EEEs 全基因组CNVs 的分析报道。 本研究将从临床特点和全基因组CNVs 分析两方面 对不明原因EEEs 展开探讨。 1　资料与方法 1.1　研究对象

2012 年7 月至2013 年4 月我院小儿神经专科 门诊及住院部诊断为不明原因EEEs 患儿，纳入标 准：1 岁以内起病，临床表现为癫癎；伴以下条件 之一：（1）新生儿不明原因的痉挛、耐药癫癎、癫癎持续状态；（2）癫癎伴精神运动发育停滞或 倒退、运动障碍、头围改变、步态异常；（3）国 际抗癫癎联盟确认的可以在1 岁内起病的EEEs； （4）特殊的脑电图改变（爆发- 抑制、高度失 律、发作间期弥漫性慢波背景伴癫癎样放电持续 发放）；⑸头颅MRI 异常（胼胝体发育不良、脑 萎缩等）。

排除标准：（1）血串联质谱和（或）尿气 相色谱- 质谱检查提示代谢病；（2）获得性脑损 伤：缺血缺氧性脑病、脑血管病变、外伤、颅内 感染、宫内感染等；（3）孤立的皮层发育异常； （4）染色体病及临床表型明确的单基因病。 1.2　资料采集

回顾性分析60 例不明原因EEEs 临床资料， 包括家族史、母孕史、癫癎起病年龄、发作形式、 精神运动发育评估、头围、血氨、血乳酸、脑电图、 颅脑影像学表现、治疗及预后。 1.3　全基因组CNVs 检测

经患儿家属同意后采集患儿及父母外周血 5 mL，EDTA 抗凝；采用血液基因组DNA 提取试 剂盒（天根公司）说明书操作提取DNA。全基因 组CNVs 检测使用Illumina 公司的SNP array 芯片 系统平台，HumanCyto-SNP12 Beadchips 包含有30 万个SNP 探针位点，平均每张芯片上每个探针的 重复数可高达30 次，探针分布覆盖245 种疾病 位点，HumanOmni-zhonghua 包含90 万个SNP 探 针位点。具体实验流程参照文献[8]。所得数据经 正常人群数据库DGV 数据库（http://projects.tcag. ca/variation），异常表型数据库（https://decipher. sanger.ac.uk）在线孟德尔遗传性疾病数据库OMIM （www.ncbi.nlm.nih.gov/omim） 以及PUBMED 分析 是否有已知致病性CNVs，对致病性或可疑致病 性CNVs 则行FISH 检测，并对父母进行检测做来 源分析，通过以上综合分析得出致病性CNVs。 目前认为：（1）新发的CNVs 位于已知的微缺失 微重复综合征区域内，或者与相关的综合征临床 表型相符考虑致病；（2）CNVs 片段的断裂点处 打断某些已知的致病性基因，且其临床表型符合 相关基因突变的临床表型时考虑致病；（3）新发 的>3 Mb 的CNVs 片段是致病的[8]；（4）新发的 微缺失是致病的；（5）新发的重复可疑致病； （6）>1 Mb 的变异无论是否遗传或来源不明均可认为可疑致病[6]。（7）在正常人群的CNVs 研究中， 3 个以上的研究小组均发现有该CNVs 的记录，可 以认为是多态性改变。 2　结果 2.1　临床特点

60 例不明原因EEEs 患儿中，男44 例，女16 例，起病年龄为2 d 至1 岁，3 个月内起病21 人， 4~6 个月起病26 人，7~12 个月起病13 人，平均 起病年龄5.1±3.3 个月。根据临床表现及脑电图 特点临床诊断：WS 34 例（57%），OS 3 例（5%）， Dravet 综合征3 例（5%），余20 例（33%）分型 不明确。

60 例患儿中1 例为领养儿，余59 例家族中有 癫癎和（或）智力低下者8 人。母亲既往有自然 流产史者4 例，死胎史者1 例；母孕期间有先兆 流产表现12 例。

34 例WS 患儿表现为痉挛发作，6 例合并强 直或强直- 阵挛发作，1 例合并部分运动性发作； 3 例OS 患儿表现为痉挛发作，其中1 例合并强直- 阵挛发作；3 例Dravet 综合征患儿以肌阵挛、强直 阵挛发作为主，可伴部分性发作；20 例分型不明 确EEEs 患儿中8 例为强直或强直阵挛发作；5 例 为肌阵挛发作；3 例为多种发作形式（强直- 阵挛 并部分运动性发作或痉挛发作）；2 例为痉挛发作； 2 例为部分性运动发作。

根据世界卫生组织（WHO）和美国智力低下 协会（AAMD）的智力低下分级标准[9]，轻度智力 缺损（IQ 50~69）14 人（23%），中度智力缺损（IQ 35~49）22 人（37%），重度智力缺损（IQ 34 以下） 24 人（40%）。

共统计了54 例患儿头围，其中（x + s ~ x + 2 s） 2 例（4%），（x ~ x+s）3 例（6%），（x-s ~ x） 11 例（20%），（x-2 s ~ x-s）11 例（20%）， （x-3 s ~ x-2 s）18 例（33%），≤ x-3 s ）9 例（17%）。

51 例患儿检测了血氨（参考值10~47 μmol/L）， 平均44±24 μmol/L，其中15 人（29%）血氨升高 （ 平均68±30 μmol/L），最高值144 μmol/L；46 人检测了血乳酸（参考值0.5~2.22 mmol/L），平均 2.8±1.4 μmol/L，其中19 人升高（3.8±0.93 mmol/L）， 最高值6.4 mmol/L。

34 例WS 患儿脑电图改变为发作间期高度失 律或间断高度失律，其中1 人醒睡各期或非快速 眼动期（non-rapid eye movement,NREM）放电指数 达95%；3 例OS 患儿脑电图表现为睡眠期间断爆 发- 抑制，1 例醒睡各期或NREM 期放电指数达 95%。3 例Dravet 综合征患儿中，2 例提示全导棘 慢波、多棘慢波发放，1 例为局灶尖棘波发放；20 例分型不明确不明原因EEEs 患儿4 例提示高度失 律，4 例全导棘波、棘慢波、多棘慢波爆发。4 例 提示电背景活动慢化，4 例为多灶性尖波、尖棘波 发放，其中2 例监测到部分运动性发作；2 例表现 为爆发- 抑制，1 例为发作期全导低电压，1 例为 全导慢波阵发。

60 例不明原因EEEs 患儿6 例完善头部CT 平 扫或平扫增强，54 例完善颅脑MRI 平扫或平扫增 强，其中11 例提示脑外侧裂增宽或外部性脑积水， 4 例侧脑室增宽，胼胝体发育不良3 例，3 例脑白 质异常信号，2 例透明隔囊肿，3 例蛛网膜下囊肿， 34 例无明显异常。

34 例WS 患儿中27 例采用ACTH 冲击治疗联 合1~3 种抗癫癎药物，2 例采用2~3 联抗癫癎治疗， 1 例单药治疗，20 例癫癎已控制，12 例未控制， 2 例死亡。20 例未分型癫癎脑病患儿9 例单药治 疗，11 例2~3 种抗癫癎药物联合治疗，8 例癫癎 已控制，8 例未控制，3 例死亡，失访1 例。3 例 Dravet 综合征患儿予3 联抗癫癎治疗、3 例OS 患 儿予ACTH 联合1~2 种抗癫癎药物治疗均未控制。 2.2　全基因组CNVs 分析结果

（1） 全基因组CNVs 结果：60 例不明原因 EEEs 患儿中，5 例患儿携带7 个致病性或可疑致 病性CNVs，阳性率为8%，具体位点见表 1。

表 1 致病性或可疑致病性CNVs 详情

（2） 基因型表型分析：① 1q43q44 微缺失 可导致一系列已明确临床症状，包括不同程度的 智力障碍、语言发育迟缓、面部及手足异常、小 头畸形、胼胝体发育不良、癫癎[10]，与患儿1 临 床表现相符。经FISH 验证及父母来源分析确定 为1q43q44 微缺失合并9p24 微重复新发突变， 致病性明确，且为首次报道。②异常表型数据 库265 334 患者2q37.3 出现0.15 Mb 微缺失，表 现为智力低下、多动及面容异常，表明2q37.3 可 能与智力障碍及癫癎相关，为可能致病性突变。 ③ 2q24.3-q31.1 微缺失部分包括17 个基因，其中包括部分SCN1A：电压门控钠离子通道α 亚单位 神经亚型Ⅰ型（OMIM：182389），为Dravet 综合 征致病基因[11, 12]，符合患儿临床诊断，经FISH 验 证及父母来源分析为新发突变，致病性明确。缺 失部分还包括 SCN9A（OMIM：603415）、SCN7A （OMIM：182392），Singh 等 [13] 认为SCN9A 对 Dravet 综合征有修饰作用，而Gorter 等 [14] 发现癫 癎大鼠模型及癫癎患者海马区SCN7A 基因的持续 表达可能与颞叶癫癎的进展相关，因此SCN9A、 SCN7A 与Dravet 综合征的关系值得进一步探讨。 ④ 3p24.1-23 微重复片段共包含5 个非癫癎相关基 因。异常表型数据库275459 患儿3p24.1 的微重复 与精神异常相关；Chioza 等 [15] 经全基因组连锁分 析证实3p23-p14 与儿童失神癫癎相关。⑤异常表 型数据库285 007 患儿3q25.32 存在0.15 Mb 微重复， 与智力障碍及肥胖有关。异常表型数据库多个患 者（282150、281079、278411 等）17q12 的微重复 与智障、癫癎、小头畸形相关，提示为致病性变 异可能性大。 3　讨论

本研究60 例不明原因EEEs 患儿中，男性病 例较多，男女比例为2.75 : 1，且多于新生儿期及 婴儿早期起病，平均发病年龄5±3 个月，78% 在 6 个月以内起病。在所有已知EEEs 中以婴儿痉挛 症发病率最高，为0.16~0.45‰ [16, 17]，本组患儿中， 婴儿痉挛症（WS）最常见，占57%，而分型不明 确者占33%。已知综合征患儿临床及脑电图表现 典型，分型不明确的不明原因EEEs 患儿癫癎发作 形式以强直/ 强直- 阵挛、肌阵挛及痉挛发作为主， 脑电图表现多样，包括高度失律、全导棘波、尖棘 波、棘慢波爆发，电背景活动慢化、爆发- 抑制等。由于其临床表现多样，脑电图表现无规律可循，目 前对分型不明确癫癎性脑病报道甚少，加强对该类 患儿临床特点总结及遗传病因学诊断，有助于提高 不明原因EEEs 的诊疗水平。

51 例检测了血氨水平的患儿中15 例（29%） 血氨升高；46 例检测了血乳酸的患儿中，19 例 （41%）血乳酸升高，提示不明原因EEEs 患儿存 在不同程度的代谢异常。54 例检测了头围的患儿 中，49 例（91%）头围位于同性别同龄均值及以 下，小头畸形占总人数的17%。35% 患儿颅脑影 像学检查提示脑发育不良或脑萎缩。经抗癫癎治疗 后47% 患儿癫癎已控制，但76% 患儿伴有中重度 智力障碍，随访1~1.5 年有5 例死亡，说明不明原 因EEEs 致残致死率高。

如何明确不明原因EEEs 病因，通过提高产 前诊断水平减少此类患儿出生是目前亟待解决的 问题。本研究是国内首次对不明原因EEEs 行全 基因组CNVs 筛查，阳性率达8%（5/60），与 Mefford 等 [6] 报道相仿。5 例患儿携带可疑或致病 性CNVs，涉及区域有1q43-q44、9p24、2q37.3、 2q24.3-q31.1、3p24.1-23、3q25.32-25.33、17q12， 未包含Mefford HC 团队已报道的癫癎脑病热点 CNVs：15q13.3、16p13.11、15q11.2，可能与样本 量少或种族差异有关。全基因组CNVs 分析费用 低、周期短，在有效检测微缺失/ 重复的同时还可 定位新的EEEs 候选基因，但遗憾的是由于本组样 本量较少，CNVs 阳性结果中无重复变异片段，因 此未发现新的EEEs 候选基因。本研究通过全基因 组CNVs 分析丰富了不明原因EEEs 基因型，提高 了对不明原因EEEs 的病因诊断水平，为患儿家庭 再生育的遗传咨询提供了理论依据，是一种值得推

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