近年来，随着流式细胞术的推广，淋巴细胞 免疫分型已逐渐成为临床医学中的常规检测项目 之一。评价不同疾病患儿的淋巴细胞亚群分布变 化，必须以健康儿童的正常结果为参照，而健康 儿童淋巴细胞亚群也会受多种因素影响，为此， 我们对124 例健康儿童进行了淋巴细胞免疫分型影响因素分析，旨在为临床医生正确判断疾病的 免疫状态提供可靠的参考依据。 1　资料与方法 1.1　一般资料

选取于深圳市宝安区妇幼保健院产科分娩的 健康足月儿45 例及儿童保健科行正常体检儿童79 例为研究对象。45 例足月儿中，男27 例，女18 例， 其中顺产22 例，剖宫产23 例（选择母亲产程未 启动择期剖宫产者）。79 例体检儿童按年龄分为 28 d~ 组（25 例），男13 例，女12 例；1 岁~ 组 （26 例），男16 例，女10 例；3~6 岁组（28 例）， 男12 例，女16 例。 1.2　仪器与试剂

流式细胞分析仪（ 美国BD 公司，型号： Canto Ⅱ ）；FACSCanto Software（ 美国BD 公 司）。FACS 7-Color Setup Beads（ 美国BD 公 司，货号：335775，批号：33417）；Multitest 6-Color TBNK with BD TruCount Tubes（CD3FITC/ CD16PE+CD56PE/CD45PerCP-Cy5.5/CD4PE-Cy7/ CD19APC/CD8APC-Cy7，美国BD 公司，货号： 337166，批号：40089）；FACSTM Lysing Solution（美 国BD 公司，货号：349202，批号：4043511）。 1.3　方法

采集新生儿脐动脉血1.0 mL 及正常体检儿童 静脉血0.5~1.0 mL 为样本，均以EDTA-K2 抗凝。

实验步骤：（1） 每日开机后以BD FACS 7-Color Setup Beads 检查校准仪器。（2）准确吸 取EDTA 抗凝全血100 μL 及BD Multitest 6-Color TBNK 20 μL，加入 BD TruCount Tube，充分混匀，置室温暗处15 min；再加入1×BD FACSTM Lysing Solution 450 μL，充分混匀，置室温暗处15 min， 2 h 内上机检测。（3）BD FACSCanto Software 分 析和记录样本数据，比较各组淋巴细胞免疫表型 绝对计数和百分比的差异。为保证数据的准确性， 仪器的质量控制、标本的处理和测试、数据分析 均由同一人操作。 1.4　统计学分析

应用SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学 分析，非正态分布计量资料以中位数（四分位间 距）[P50（P25，P75）] 表示，多组间比较采用非 参数Kruskal-Wallis 检验，两组比较及组间两两 比较采用非参数Mann-Whitney U 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　不同性别健康儿童淋巴细胞免疫分型比较

各淋巴细胞免疫表型绝对计数和百分比在 健康男女儿童之间比较差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 2.2　不同生产方式健康新生儿脐血淋巴细胞免疫 分型比较

T 细胞计数、Ts 计数、B 细胞百分比、NK 细 胞百分比和绝对计数在顺产和剖宫产两组新生儿 之间差异均有统计学意义（均P<0.05），见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 不同生产方式健康新生儿淋巴细胞亚群比较　[P50（P25，P75）]

表 1 不同生产方式健康新生儿淋巴细胞亚群比较　[P50（P25，P75）]

各年龄组之间T 细胞百分比与计数、Th 细胞 百分比与计数、Ts 细胞百分比、B 细胞百分比与 计数、NK 细胞百分比及Th/Ts 差异均有统计学意 义（均P<0.05），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同年龄组健康儿童淋巴细胞亚群比较　[P50（P25，P75）]

表 2 不同年龄组健康儿童淋巴细胞亚群比较　[P50（P25，P75）]

出生后B% 和Ts% 开始上升，其它各淋巴细 胞免疫分型百分比呈现出下降趋势；自第28 天起， B% 开始下降并持续至6 岁，Ts% 一直呈轻度上升 趋势，Th% 一直为下降趋势，而T%、NK% 则开 始回升，并持续至6 岁。见图 1。

图 1 0~6 岁儿童淋巴细胞表型百分率变化趋势

除NK 细胞外，出生后T 细胞、Ts 细胞、Th 细胞和B 细胞的绝对计数均呈上升趋势，第28 天 达到顶峰，此后随年龄增长而下降并持续至6 岁， 而NK 细胞绝对计数则一直呈下降趋势。见图 2。

图 2 0~6 岁儿童淋巴细胞表型绝对计数变化趋势

0~6 岁儿童的保健服务是妇幼保健服务的重 要内容，对降低儿童死亡率、促进儿童生长发育 和健康成长起着重要作用。0~6 岁也是儿童各种常 见病的好发年龄，是我院门诊和住院病人的主要 人群之一。淋巴细胞免疫分型能很好地反映机体 当前的免疫功能、状态和平衡水平，是检测细胞 免疫和体液免疫功能的重要指标^[1]。有研究报道毛 细支气管炎、重症肺炎支原体感染、脓毒症患儿 都存在着不同程度的细胞免疫功能紊乱，其程度 与疾病的严重程度有明显的关联^{[2, 3, 4]}。由于儿童处 于生长发育阶段，其机体免疫系统将经历逐渐成 熟的过程，不同的生长发育阶段淋巴细胞亚群分 布亦不同^{[1, 5, 6]}，6 岁之前的儿童体内淋巴细胞亚群 处于一个非常活跃的量变过程，从6 岁之后，外 周血的淋巴细胞亚群分布逐渐稳定^[7]。因此临床儿 科领域需要有不同于成年人的淋巴细胞亚群的相 对及绝对计数正常参考范围。

本组资料显示，顺产和择期剖宫产分娩的新生儿淋巴细胞亚群部分指标差异有统计学意义， 与国内班开斌等^[8]、刘克芹等^[9] 研究成果相同。 生产方式的不同导致淋巴细胞亚群在外周血中的 数量有差异，其机制可能是由于择期剖宫产本身 没有产生足够的子宫收缩，从而缺少了炎性细胞 因子的刺激，进而使淋巴细胞功能的成熟受到影 响；而自然分娩过程中胎膜破裂、节律性宫缩、 胎儿经产道时受到宫缩和产道挤压等生理过程有 利于新生儿的免疫状态的成熟^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}。

在国内外的研究中，性别、年龄因素对淋巴 细胞亚群分布的影响报道不相一致。本组资料中 不同性别健康儿童之间淋巴细胞亚群结果差异无 统计学意义，不同年龄之间差异有统计学意义，与 Garcia-Dabrio 等^[6] 研究结果一致。淋巴细胞亚群百 分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的 比例，并不能体现各种细胞在单位体积血液中的绝 对数量，不能真实地反映机体的免疫状况^[11]。且 本实验数据显示，各年龄段淋巴细胞亚群的百分比 和绝对计数随年龄变化上升或下降的趋势各不相 同，所以疾病诊断或评估机体免疫状态时，需同时 检测外周血淋巴细胞亚群百分比和绝对计数。因年 龄对淋巴细胞亚群影响较大，因此建立儿童淋巴细 胞亚群正常参考范围时应按年龄分段。

目前，临床使用流式细胞术检测淋巴细胞 亚群灵敏度高、重复性好，是一种快速、准确 的评估和检测机体免疫状态的方法^[12]。本组资 料采用BD FACSCanto Ⅱ 双激光六色流式细胞 分析仪、六色荧光标记抗体、BD 公司的专利技 术-TruCount tube 和专用的BD FACSCanto 软件， 再加上精确的全血反向加样技术，最终计算出各 细胞亚群相对及绝对计数，其在方法学上具有无 可比拟的优越性。操作者在获取细胞时应遵循： （1）T%+B%+NK%=100±5%；（2）CD⁴⁺ T%+ CD⁸⁺ T% = T±2%^[13]。但由于所用仪器和试剂、实 验方法和条件、甚至同一机型所用软件的不同， 都会导致检测的参考值存在差异^{[14, 15]}，因此各流 式细胞术实验室均应建立自己的参考值。

本研究的不足之处：（1）在年龄分组上不够 细化，特别是新生儿有其自身的生理特点，更应 对此特殊群体设组统计分析。（2）由于收集正常 儿童血标本困难，各组纳入的例数不足，外周血 淋巴细胞亚群的分布结果可能存在偏倚。（3）有 文献报道，身体质量指数、运动等对外周血淋巴细胞亚群分布有影响^[6]，但本组资料未评估此因素。