儿童肥胖的发病率呈逐年上升趋势，美国 在2009~2010 年间进行的全国健康和营养调查发 现，儿童和青少年的肥胖发病率为16.9%^[1]，我 国10 年前的大规模调查显示儿童肥胖的发病率为 5%~8%^[2]，近年张格祥等^[3] 通过对兰州市城区3~ 6 岁儿童2001~2010 年的体格发育趋势分析，显示 超重和肥胖的平均患病率呈逐年上升。已知摄入 过多脂肪等高热量饮食是导致肥胖的重要原因之 一，虽然随着全民健康教育水平的普及和推广， 越来越多的人们已经意识到高脂饮食及肥胖对自 身及后代健康的危害，并自觉地进行预防和干预， 但大量的人群研究显示，母亲高脂饮食以及肥胖 对后代的危害仍然是一个重要的社会问题^[4]。但目 前的报道多侧重于高脂饮食导致的母亲肥胖对后 代体重、代谢异常及心血管疾病危险性的研究^{[5, 6, 7, 8]}， 而关于母亲高脂饮食对后代骨骼影响的报道很少。 本课题组的前期研究显示，幼鼠在高脂饮食喂养 5 周后导致了非酒精性脂肪肝，同时出现了生长 障碍，并伴随有胰岛素样生长因子-I（insulin-like growth factor,IGF-I）的表达下降^[9]。因此，本研究 希望在前期研究的基础上利用高脂饮食建立动物 模型，观察母鼠孕前和孕期高脂饮食对新生仔鼠体 长的影响，加强对母亲肥胖所致后代生长发育障 碍的认识。IGF-I 对生长有促进作用^[10]，其与受体 结合后，磷酸化胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1,IRS-1），并可通过激活磷酯酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/ 蛋白激 酶B（protein kinase B,AKT1）和促分裂原活化蛋 白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK） 两条信号转导通路而调节骨骼生长。因此，本研究 进一步检测了母鼠高脂饮食后仔鼠IGF-I 的变化、 以及IGF-I 对以上两条信号通路的影响，初步探讨影响胎儿骨骼生长的病理机制，为临床采取措施 早期干预提供实验依据。 1　材料与方法 1.1　实验动物与分组

64 只3 周龄断乳Sprague Dawley 大鼠购于军 事医学科学院实验动物中心，其中雌鼠40 只，雄 鼠24 只，体重50~60 g。将40 只雌性大鼠随机分 为高脂组和对照组，每组20 只。 1.2　试剂与材料

35% 高脂饲料（ 总热量5 240 kcal/kg，脂 肪占能量比例为60%） 和普通饲料（ 总热量 3 850 kcal/kg，脂肪占能量比例为10%）购于北京 华阜康生物科技股份有限公司。IGF-I 酶联免疫 吸附试验试剂盒购于美国R&D Systems 公司，抗 PI3K 抗体、抗磷酸化PI3K（Phospho-PI3K）抗体、 抗AKT1 抗体、抗磷酸化AKT1（Phospho-AKT1） 抗体、抗IRS-1 抗体和抗磷酸化IRS-1（Phospho- IRS-1）抗体均购于美国abcam 公司，抗MAPK 抗 体和抗磷酸化MAPK（Phospho-MAPK）抗体均购 于美国CST 公司。 1.3　动物模型的制备

高脂组喂养35% 高脂饲料，对照组及24 只 雄鼠喂养普通饲料。喂养8 周后，高脂组和对照 组各取8 只母鼠行苏木精- 伊红（HE）染色，观 察肝脏病理；其余按雌雄比例1 : 1 合笼交配，孕 期3 周左右，孕期分别继续给予高脂饮食或普通 饲料喂养。仔鼠出生后检测各项指标。 1.4　仔鼠体长测量及血清学检测

仔鼠出生24 h 内使用游标卡尺测量鼻尾长度 （鼻尖到尾尖）后，断头取血，离心后取上清液，酶联免疫吸附试验测定血清IGF-I 水平。 1.5　组织病理分析及免疫组织化学检测

高脂组和对照组各取10 只仔鼠的肝脏组织， 行HE 染色，光镜下观察肝脏组织病理情况。同 时取两组仔鼠的左下肢长骨（胫骨、股骨），10% 中性甲醛溶液固定72 h，然后进行脱水、透明、浸蜡、 包埋、制片，应用免疫组化EnVision 法标记骨组 织切片IRS-1 和Phospho-IRS-1；采用IPP（Image- Pro Plus，Media Cybernetics 公司，美国）图像分析 软件分析长骨组织切片IRS-1 的含量，每个样本随 机选取3 张切片，每张切片随机选取6 个视野， 读取阳性区域的积分光密度值和平均吸光度值， 取每组均值进行比较。 1.6　蛋白质印迹技术

两组各另取6 只仔鼠左下肢长骨（胫骨、股 骨）存于-80℃冰箱待检，检测仔鼠长骨PI3K/ Phospho-PI3K、AKT1/Phospho-AKT1、MAPK/ Phospho-MAPK 的蛋白表达量。常规行SDS-PAGE 电泳，将蛋白转移至PVDF 膜，加入一抗后4℃过 夜。第2 天洗膜，加入相应二抗37℃孵育1 h 后， 应用WCL 法行化学发光、显影、定影，最后用 Quantity One 软件分析各蛋白图像的灰度值，以与 内参β-actin 的灰度值之比作为其蛋白的相对表达 量。 1.7　统计学分析

应用SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学 分析，符合正态分布的计量资料用均数± 标准差 （x±s）表示，两组比较采用两个独立样本t 检验。 P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　两组仔鼠的体长比较

高脂组共产95 只仔鼠，平均体长67±4 mm； 对照组共产128 只仔鼠，平均体长77±4 mm。 两组比较，高脂组仔鼠的体长较对照组显著降低 （t=-2.282，P=0.023）。 2.2　两组仔鼠的血清IGF-I 水平比较

高脂组仔鼠血清IGF-I 水平为43±17 pg/mL，对照组为54±12 pg/mL，高脂组较对照组下降， 但差异无统计学意义（t=-1.324，P=0.185）。 2.3　两组母鼠及仔鼠的肝脏组织病理比较

对照组母鼠和仔鼠的肝小叶结构完整，肝细 胞呈多边形，围绕中央静脉呈放射状分布，大小 一致。而高脂组母鼠及仔鼠肝组织可见脂肪样变， 肝细胞胞浆内有较多小而密的脂质沉积，肝细胞 胞浆呈透明的空泡状，小叶结构不清。见图 1。

图 1 两组母鼠和仔鼠的肝脏病理染色（苏木精- 伊红 染色，×400）　　A 和C 分别为对照组母鼠和仔鼠，肝小叶结构 完整，肝细胞呈多边形，围绕中央静脉呈放射状分布，大小一致； B 和D 分别为高脂组母鼠和仔鼠，与对照组相比，肝组织可见脂 肪样变，肝细胞胞浆内有较多小而密的脂质沉积，肝细胞胞浆呈 透明的空泡状，小叶结构不清。

免疫组化结果显示，高脂组和对照组的IRS-1 和Phospho-IRS-1 在长骨软骨细胞中均呈阳性表达， 且两组间IRS-1 表达的积分光密度值和平均吸光度 值差异均无统计学意义（均P>0.05），见表 1，图 2。

图 2 两组仔鼠长骨中IRS-1 及Phospho-IRS-1 的 表达（EnVision 法，×400）　　A 和C 分别为对照组IRS-1 和 Phospho-IRS-1 的表达；B 和D 分别为高脂组IRS-1 和Phospho- IRS-1 的表达。两组IRS-1 和Phospho-IRS-1 的表达分布均无明显 差异。IRS-1 和Phospho-IRS-1 的阳性表达呈棕黄色。

表 1(Table 1)

表 1 两组仔鼠长骨中IRS-1 的表达比较

表 1 两组仔鼠长骨中IRS-1 的表达比较

高脂组长骨软骨细胞中MAPK 表达高于对照 组（P<0.05），而PI3K 和AKT1/Phospho-AKT1 与 对照组比较差异均无统计学意义。见表 2，图 3。

表 2(Table 2)

表 2 两组仔鼠长骨中MAPK、PI3K 及AKT1/Phospho- AKT1 的表达比较

表 2 两组仔鼠长骨中MAPK、PI3K 及AKT1/Phospho- AKT1 的表达比较

图 3 Western blot 检测两组仔鼠长骨中MAPK、 PI3K 及AKT1/Phospho-AKT1 水平

目前仅有少量研究探讨了母亲孕期高脂饮食 对后代骨骼的影响，结果提示部分后代、尤其是 其中的雌性后代在成年期将出现骨小梁的结构改 变，并进一步影响长骨的结构^{[11, 12]}。在本研究中发 现，高脂组新生仔鼠体长较对照组显著降低，提 示母鼠孕期高脂饮食对胎鼠体长发育的抑制作用。 这些结果与在临床上发现的部分非酒精性脂肪肝 患儿身高增长缓慢，就诊时身高常低于同龄儿身 高的现象基本一致^[9]。文献显示，高脂饮食导致的 肥胖母鼠具有显著增多的凋亡卵泡，且卵母细胞 小而少、胚胎的IGF-I 受体染色减少，最终导致胎 鼠发育较小，提示母亲肥胖产生的不良影响可以 早至卵母细胞阶段和胚胎植入阶段，这些影响将 导致后代长期的病态^[13]。但也有文献显示，3 周龄 的小鼠在高脂饮食喂养6 周后，其体长和胫骨生 长速度、胫骨生长板高度和血清胰岛素浓度均高 于普通饮食组^[14]，这与本研究结果有所不符，作 者推测由于胰岛素抵抗和继发的高胰岛素血症导 致了骨骼的生长加速。与本研究对比，推测研究 结果的差异受到所应用高脂饮食的具体成分比例、 所选用的动物种类及年龄、高脂喂养的持续时间、 以及是否伴随代谢异常（如高胰岛素血症）等多 种因素的影响。

Kavanagh 等^[15] 研究发现，高脂饮食喂养的大 鼠，其仔鼠出生身长较短，出生后如果继续给予 高热量饮食喂养，则会发生生长追赶，成年后体 长将明显超过正常对照组。本研究的局限性在于 未能对出生仔鼠继续高脂饮食喂养并观察体长的 动态变化，有待以后进一步连续观察。尽管如此， 本研究初步的研究结果显示母亲高脂饮食对后代 体长的不良影响，提示应重视母亲孕期合理饮食 的重要性，避免过量的高脂等高热量饮食，对指 导孕妇合理营养仍具有一定的临床意义。

人体的纵向生长主要通过长骨的线性生长来 完成，骨骺软骨生长板是实现长骨纵向生长的重 要场所。在儿童生长发育过程中，IGF-I 的促生长 作用是通过介导作用于软骨生长板、刺激软骨细 胞的增殖而实现的^{[16, 17]}。IGF-1 基因敲除鼠骺板软 骨增殖受损、矿化延迟、肥大区软骨细胞减少^[18]。 Govoni 等^{[19, 20]} 通过灭活鼠软骨细胞和成骨细胞中IGF-I 的活性，发现身长分别降低7% 和14%，骨 骺板宽度分别降低7% 和20%。本研究中，高脂组 的仔鼠在出生体长下降的同时，伴有血清IGF-I 水 平下降，似乎提示，可能由于IGF-I 的下降影响了 胎鼠在宫内的生长发育。肝脏是IGF-I 合成的主要 场所，本实验显示，高脂饮食导致母鼠和仔鼠的 肝脏均出现了明显的脂质沉积，提示肝脏脂质代 谢能力下降，并影响了IGF-I 的合成。虽然未对母 鼠的IGF-I 水平进行检测，但结合既往本课题组的 研究结果^[9]，推测母鼠的IGF-I 水平同样是下降的。 IGF-I 水平下降对仔鼠体长及骨骼影响的下游机制 如何，本研究进行了初步探讨。

IGF-I 与受体结合后，磷酸化受体底物IRS-1 并使其活化，形成Phospho-IRS-1。研究显示， IRS-1 基因敲除小鼠股骨和胫骨的长度比野生型小 鼠短20%，说明IRS-1 通过对软骨细胞的调节作 用参与骨骼生长，而在IRS-1 基因敲除后IGF-I 的 作用不能传导而影响了骨骼生长^[21]。本实验结果 显示，高脂组仔鼠软骨细胞不论是基础的IRS-1、 还是活化后的Phospho-IRS-1 的表达，与对照组比 较均无明显差异。提示高脂组的IGF-I 水平虽然 有所下降，但并未影响到IRS-1 的活化。Phospho- IRS-1 激活两条信号转导通路，以调节代谢为主 的PI3K/AKT1 通路和介导促细胞增殖效应为主的 MAPK 信号通路，以促进骺板软骨细胞增殖分化、 矿化，抑制软骨细胞凋亡，缓解骺板闭合^[10]。在 这两条信号通路中，PI3K/AKT1 和MAPK 只有在 发生磷酸化后才能最大程度地发挥活性作用，并 维持活性稳定性，故研究中多以磷酸化后的表达 水平作为衡量其活性的指标。本结果中，高脂组 仔鼠软骨细胞的MAPK 表达高于对照组，而PI3K 和AKT1/Phospho-AKT1 与对照组比较均无显著差 异，限于技术原因，未能检测到Phospho-PI3K 和 Phospho-MAPK 的表达。因此，尚不能肯定母鼠高 脂饮食是否通过该两条信号通路影响仔鼠的骨骼 生长。另外，已知MAPK 存在于大多数细胞内， 在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内、引起 细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡） 的过程中具有至关重要的作用。本实验中出现高 脂组仔鼠MAPK 表达高于对照组的结果，推测是 否因为高脂饮食导致机体的一系列变化影响了其 它信号通路所致，目前尚未可知。此外，高脂饮食中不同的蛋白质和脂肪比例是否对仔鼠的生长 有不同的影响、IGF-I 下降的程度是否会对下游通 路产生不同影响、以及是否通过其它信号通路发 挥作用等，都有待于进一步研究。

综上，本研究的意义在于通过母亲孕期高脂 饮食建立动物模型，在国内率先探讨了孕前和孕 期高脂饮食对仔鼠体长及骨骼发育的影响，并希 望了解IGF-I 下降导致体长发育迟缓的病理机制。 初步结果显示，孕前及孕期暴露于高脂环境不利 于胎鼠在宫内的发育，造成仔鼠出生短小，可能 与IGF-I 的下降有关，但对骨骺板软骨的确切影响 机制尚有待进一步阐明。