新型支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）是常见于早产儿的一种慢性肺疾 病。生后高氧暴露引起肺微血管发育障碍，肺泡 化过程受阻可能是其发生发展的重要原因^{[1, 2]}。血 管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前已知最有效调控肺微血管生 成和发育的血管生成素蛋白^[3]。本课题组前期研究 发现60% 氧暴露时肺组织VEGF 及其受体表达下 降^{[4, 5]}。新近研究发现脂肪型脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4,FABP4）是调节支气管微血 管循环的重要因子，为VEGF 基因下游因子，受 VEGF 调控^[6]。本实验拟对早产大鼠进行60％氧暴 露，观察高氧肺损伤时肺组织及BALF 中FABP4 的表达，进一步探讨高氧暴露对肺血管发育信号 传导通路的影响及与BPD 发生发展的关系。 1　材料与方法 1.1　材料

健康Sprague-Dawley（SD）大鼠由郑州大学 实验动物中心提供。总RNA 提取试剂（TRIzol） 购于美国Gibco 公司；小鼠抗FABP4 单克隆抗体 购于美国Santa Cruz 公司；随机引物Oligo dT12- 18、M-MLV 逆转录酶、RNA 酶抑制剂（Rnasin） 及TaqDNA 聚合酶购于美国Promega 公司；FABP4 引物由上海英骏公司合成；ELISA 检测试剂盒购自 美国R ＆ D 公司。 1.2　动物模型的制备及分组

清洁级SD 雌雄大鼠按3 : 1 夜间合笼交配，次 日晨取雌鼠阴道分泌物涂片，镜检见精子，当日 记为妊娠第1 天，早产大鼠于母鼠孕21 d 剖宫娩 出，由当日分娩的其他母鼠作其代母鼠。早产鼠 于生后6 h 内随机分为对照组和高氧组，对照组置 于常压空气中，高氧组置于浓度为60% 的高氧舱 中，氧浓度维持在60%，每天开箱约1 h 用于添加 饲料及更换垫料，并与对照组互换母鼠以避免母 鼠氧中毒影响哺乳。当某一组新生鼠发生死亡后， 同时将其他组去掉相同数目的新生鼠，以保持各 组新生鼠数目相同，防止因营养因素引起的差异。 两组早产鼠分别于出生后第3 天（P3）、第7 天 （P7）及第14 天（P14）各取8 只，以20% 乌拉 坦0.5 mL 腹腔麻醉，气管插管保持肺充气状态，开胸放血，右支气管结扎，迅速切取右肺，用于 免疫组织化学检测。用4℃无菌生理盐水对左肺行 肺泡灌洗（2.5 mL×3 次），回收率>85％，将灌 洗液在4℃条件下，以4 000 r/min 离心10 min，取 上清，保存到-80℃冰箱中待测FABP4 的表达。 1.3　免疫组织化学染色检测FABP4 蛋白的表达

采用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶连接 法（S-P 法）检测FABP4 的表达。石蜡切片常规 脱蜡至水，抗原修复，3%H2O2 阻断内源性过氧化 物酶，正常山羊血清封闭，滴加一抗，4℃过夜， 0.01M PBS 充分洗涤后加入生物素标记的羊抗兔 IgG，37℃孵育30 min，加入辣根过氧化物酶标记 的链霉卵白素37℃孵育30 min，DAB 显色、复染 封片、镜下观察。结果判定以细胞浆有棕黄色颗 粒沉着为阳性细胞。阴性对照为0.01M PBS 替代一 抗。FABP4 抗体稀释度均为1 : 100。每例随机抽取 染色清晰的切片5 张，每张切片于光镜下随机选 取5 个视野，固定窗口面积，利用HMIAS-2000 高 清晰度彩色医学图文分析系统，测定平均吸光度 （A）以表示阳性产物的强度。 1.4　RT-PCR 检测FABP4 基因的表达

采用TRIzol 试剂提取总RNA，逆转录为 cDNA，以此为模板行PCR 扩增。FABP4 基因及内 参基因引物序列见表 1。PCR 反应体系（25 μL）： 2×MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，β-actin 上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，灭菌水8.5 μL。 PCR 反应条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性 45 s，53.6℃退火45 s，72℃延伸1 min，共32 个循环； 最后72℃延伸7 min。然后用1.5% 琼脂糖凝胶电 泳30 min。结果在MUVB220 凝胶分析系统（美国 Ultralum 公司）对扩增产物条带进行分析，分别测 定各扩增带吸光度（A 值），将目的基因FABP4 扩增带分别与内参照β-actin 扩增带的A 值比作 为其mRNA 水平的定量指标。

表 1(Table 1)

表 1 PCR 引物序列

表 1 PCR 引物序列

采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法（ELISA） 检测BALF 中FABP4 的含量，操作步骤严格按说 明书进行。 1.6　统计学分析

应用SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，两 组间比较采用t 检验；多组间比较采用单因素方差 分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P<0.05 为 差异有统计学意义。 2　结果 2.1　两组早产大鼠肺组织FABP4 蛋白检测结果

FABP4 主要在肺巨噬细胞、支气管上皮细胞 和血管内皮细胞表达。两组FABP4 蛋白的表达随鼠龄递增，呈逐渐升高的趋势，至P14 时最高。 与对照组相比，高氧组FABP4 蛋白的表达在P3、 P7 及P14 均高于对照组，且差异有统计学意义（均 P<0.05）。见表 2、图 1。

图 1 FABP4 在不同时间点两组早产大鼠肺组织中的表达（S-P 法，×400）各时间点对照组FABP4 均有少 量表达，同时间点高氧组FABP4 较对照组明显增多，胞浆有棕黄色颗粒沉着为FABP4 阳性表达。

表 2(Table 2)

表 2 不同时间两组早产大鼠肺组织FABP4 蛋白水平比较 注：a 示与同组P3 时比较，P<0.05；b 示与同组P7 时比较，P<0.05。

表 2 不同时间两组早产大鼠肺组织FABP4 蛋白水平比较

检测发现两组大鼠FABP4 mRNA 表达均随鼠 龄递增，至P14 时达峰值。与对照组相比，高氧 组FABP4 mRNA 水平在P7 和P14 均高于对照组， 且差异有统计学意义（均P<0.05）。见表 3、图 2。

图 2 RT-PCR检测不同时间两组早产大鼠肺组织FABP4 mRNA表达情况M：Marker，1 000 bp DNA ladder；1、 3 和5 分别为P3、P7 和P14 时对照组；2、4 和6 分别为P3、P7 和P14 时高氧组。

表 3(Table 3)

表 3 不同时间点两组早产大鼠肺组织FABP4 mRNA 水平比较　 注：a 示与同组P3 时比较，P<0.05；b 示与同组P7 时比较，P<0.05。

表 3 不同时间点两组早产大鼠肺组织FABP4 mRNA 水平比较

检测发现两组大鼠BALF 中FABP4 含量均随 鼠龄递增而逐渐增加，至P14 时达峰值。与对照 组相比，高氧组大鼠BALF 中FABP4 蛋白的表达 在P7 及P14 均高于对照组，且差异有统计学意义 （均P<0.05）。见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 不同时间两组早产大鼠BALF 中FABP4 含量的比较 注：a 示与同组P3 时比较，P<0.05。

表 4 不同时间两组早产大鼠BALF 中FABP4 含量的比较

近年来，随着新生儿重症监护水平的提高， 越来越多的早产儿得以存活。新型BPD 发病率也 逐年增高^[7]。与以肺纤维化为主要病理特征的传 统BPD 比较，新型BPD 患者肺泡结构简单化，肺 泡数目和表面积减少，肺泡化和肺微血管发育停 滞，提示肺发育在管道形成期受到干扰或停滞^[8]。 VEGF 是调节肺微血管生成和发育的重要因子。 VEGF 及其受体表达减少是引起新型BPD 发生的 重要原因^{[4, 8, 9]}。但其具体机制目前不清。本研究从 VEGF 下游因子FABP4 与微血管发育之间信号传 导途径入手，进一步探讨高氧暴露对肺微血管发 育信号传导通路的影响，有助于阐明新型BPD 发 生的分子机制，可望带来防治领域的突破。

肺微血管发育主要包括支气管微血管发育 和肺泡微血管发育。传统研究多集中在肺泡微血 管发育，对支气管微血管发育研究则甚少^[10]。 FABP4 是FABPs 家族的一员，是主要调节支气管 微血管发育的重要因子及VEGF 的下游因子，其 表达受VEGF 调控^{[6, 11, 12]}。本研究发现高氧肺损伤 时除肺巨噬细胞有大量FABP4 表达外，支气管上 皮细胞和血管内皮细胞均有表达。这与Shum 等^[13] 研究表达部位一致，而与Ghelfi 等^[10] 研究表达部 位略微不同，可能是因为研究对象不同：本研究 对象为SD 大鼠，而Ghelfi 等^[10] 研究对象为狒狒。

本研究发现随鼠龄增加及高氧暴露时间延 长，肺组织FABP4 表达均较对照组增加。这与本 课题组前期研究发现高氧暴露肺损伤时VEGF 及 其受体2 的表达减少正好相反。其可能机制为： （1）新近研究认为肺毛细血管发育包括支气管毛 细血管网发育和肺泡毛细血管网发育。VEGF 主要 由肺泡上皮细胞合成，通过旁分泌途径作用于肺 泡毛细血管网。而FABP4 则主要由肺泡巨噬细胞、 支气管血管内皮细胞及支气管血管上皮细胞合成， 作用于支气管毛细血管网，因此，高氧肺损伤时， 二者由于分泌细胞受损程度不同，反应不同^{[6, 13]}。 （2）高氧肺损伤时随着高氧暴露时间延长，肺巨 噬细胞逐渐流入聚集，引起FABP4 表达逐渐增加。 而目前研究认为FABP4 在促进支气管毛细血管网 生成的同时，又可抑制肺泡上皮细胞分泌VEGF 及其受体2，VEGF 及其受体2 分泌减少可使肺泡毛细血管网生成障碍^[11]。因此高氧肺损伤时主要 是抑制肺泡微血管发育，引起肺微血管病理性重 塑，肺泡化合成受阻。

本研究还发现高氧肺损伤时BALF 中FABP4 表达增多。这可能与FABP4 是低分子蛋白 （<14 kd），在高氧肺损伤时容易从损伤细胞渗 漏到BALF 中有关。也有学者研究发现BPD 患 儿BALF 中FABP4 含量增多^{[14, 15]}。提示BALF 中 FABP4 含量可作为监测BPD 发生发展的重要指标。

综上所述，高氧肺损伤可能通过调控FABP4 与VEGF 信号传导通路，使肺微血管发育障碍， 发生病理性重塑，肺泡化合成受阻，进而导致新 型BPD 的发生。同时BALF 中FABP4 含量可作为 监测新型BPD 发生发展的临床标志物。