健康成人携带微生物所编码的基因多于人体 自身基因组的100 倍^{[1, 2]}，被称为人类的“第二基 因组”^[3]，这些微生物大部分寄居在肠道，肠道菌 群对于消化吸收营养物质、抑制病菌及调节免疫 都发挥着重要作用^[4]。新生儿、婴儿期是肠道菌群 定植、发育的重要阶段，此期肠道菌群的失衡可 能会影响远期甚至成年后的健康^[1]。因而，了解新 生儿、婴儿期肠道菌群的发展模式及特点对研究 相关疾病、改善人口质量有重要意义。

对肠道微生态的研究以往多采用培养或传统 分子生物学（如PCR、变性梯度凝胶电泳）方法， 但它们对于研究复杂的肠道菌群有明显的局限性，而宏基因组学研究则可以避免上述方法的缺陷^[5]， 近年已逐渐应用于婴儿肠道微生态研究^{[2, 3]}，但多 集中于欧美发达国家，国内仅见零星报道^[6]。由于 基因以及饮食等生活习惯的差异，不同地域人的 肠道菌群构成有显著差异^{[7, 8]}，因此有必要研究我 国婴儿肠道宏基因组特征。

婴儿肠道菌群的建立是一个连续、变化、受 很多因素影响的过程，以往研究多局限于一个时间 点，专注于某一种因素如喂养^[6]、生产方式^[9]、抗 生素^[8] 等的影响，缺乏连续性认识。本研究将采 用以Illumia 为测序平台的16S rDNA 新一代高通量 测序技术对5 例健康婴儿1 岁以内的粪便细菌基因 组进行连续分析，探讨婴儿时期肠道宏基因组的动 态变化，为以后大规模研究中国婴儿肠道菌群分布 特征及婴儿肠道微生态相关疾病提供参照。 1　资料与方法 1.1　研究对象

征得我院伦理委员会批准及婴儿父母知情同 意后，选择5 例出生于深圳市宝安区妇幼保健院、 胎龄37~40 周的健康足月新生儿为研究对象，记 录围产期信息及1 岁以内喂养方式、疾病和用药 信息（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 婴儿围产因素及喂养方式等信息

表 1 婴儿围产因素及喂养方式等信息

生后3 d、1 个月、6 个月和1 岁时用无菌标 本盒留取粪便样本共17 份，其中1~3 号婴儿样本 收集至生后6 个月各3 份，4、5 号婴儿收集至1 岁各4 份，提取细菌总DNA（QIAamp DNA Stool Mini Kit，德国QIAGEN 公司），保存于-70℃。 冷藏条件下送至深圳华大基因科技服务有限公司 进行测序及生物信息分析。 1.3　16S rDNA 宏基因组测序

检测合格的粪便DNA 样品用细菌通用引物进 行16S rRNA 基因V6 区PCR 扩增，引物序列为： 967F（v6） ：CAACGCGAAGAACCTTACC，1046R （v6） ：CGACAGCCATGCANCACCT； 回收主要 DNA 片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase 和T4 PNK 将打断形成的粘性末端修复 成平末端，再通过3' 端加碱基“A”，使得DNA 片段能与3' 端带有“T”碱基的特殊接头连接以 构建文库；用合格的文库进行cluster 制备；应用 Hiseq 2000 测序仪（Illumina 公司，美国）对扩增 的16S rDNA V6 高变区序列进行测序，测序长度 为64 bp，测序类型：101 PE 测序；对原始的测序 数据进行处理（去除接头污染、含N 的碱基数和 低复杂度reads），获取clean data。 1.4　物种分类与丰度分析

将clean data reads 拼接成tags； 利用Mothur （version 1.27.0）软件包对tags 序列进行去冗余处 理，从中挑选出unique tag 序列；将unique tags 进 行物种注释并聚类成 Operational Taxonomic Units （OTU），tags 和OTU 的数量初步说明了该样品 是否具有丰富的物种；然后通过OTU 注释（基于 包含的tags 的物种注释结果）完成物种组成和分 类分析，可在界、门、纲、目、科、属、种水平， 将每个注释上的物种或OTU 在不同样品中的序列 数进行整理。本研究中，每个样品均有80% 以上的tags 在科水平上得到分类，因此最佳的分类水 平为科。 1.5　α 多样性分析

利用Mothur 软件计算样品的α 多样性值， 包括chao1 值、ACE 值、Shannon、npShannon 以及 Simpson 指数，α 多样性是对单个样品中物种多样 性的分析，前面4 个指标数值越大，最后一个指 标越小，说明样品中的物种越丰富。 2　结果 2.1　样品测序数据

17 份粪便细菌总DNA 样品共产生原始测序数 据为2 190.66 Mbp，每一样品产生的clean data 序 列平均为124 Mbp（116~131 Mbp），每一样品信 息的利用率都在94% 以上。 2.2　物种分类和丰度分析

OTU 数量最少为36，最多达308，随年龄的 增长而增加，表明婴儿粪便样品中微生物丰度随 时间而增加，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同时间点OTU 及α 多样性指数( 均值)

表 2 不同时间点OTU 及α 多样性指数( 均值)

20 个菌门被检出细菌基因组，但主要分布于 4 个菌门，分别是变形菌门 （Proteobacteria）、厚 壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes） 和放线菌门（Actinobacteria）；不同个体之间，同 一个体的不同时段，其物种组成有差异，除1 号 婴儿集中于拟杆菌门和变形菌门外，其余婴儿样 品均集中于变形菌门和厚壁菌门。

图 1 为各样品丰度>1% 的菌群在为Family （ 科） 水平tags 的相对百分比。优势菌群包 括： 变形菌门下的Enterobacteriaceae（ 肠杆菌 科）、Vibrionaceae（ 弧菌科）； 厚壁菌门下的 Lachnospiraceae（毛螺旋菌科）、Streptococcaceae （链球菌科）和Clostridiaceae（梭菌科）；拟杆 菌门下的Bacteroidaceae（拟杆菌科）；放线菌门 下的Bifidobacteriaceae（双歧杆菌科）。

图 1 各样品tags 中>1% 的菌群在科水平的相对比例横轴数字1、2、3、4、5 为婴儿编号，a、b、c、d 分别代表 3 d、1 个月、6 个月和1 岁时间点。

从图中可以看出：虽然肠杆菌科出现于所有 婴儿粪便，甚至2 号婴儿生后1 个月时的粪便几 乎达90%，但不同婴儿之间菌群组成有明显差异， 例如1 号婴儿粪便中占主要比例的拟杆菌科在其 他婴儿的粪便中几乎没有出现或比例很小；出生3 d 时，虽然菌群种类存在差异，但总的趋势是结 构简单，主要由2~4 种物种组成，随着日龄延长， 物种组成逐渐丰富，菌群结构趋向复杂，生后1 个月、6 个月时样品中>1% 物种最多7 种，1 岁时 达10 种之多；同一婴儿不同时段的菌群构成虽随 着日龄而复杂化，但种类相似，如1 号婴儿粪便 一直以拟杆菌科占优势，而2、3、4 号婴儿粪便 中则肠杆菌科一直占优势；值得一提的是，益生 菌群双歧杆菌科在婴儿粪便中并不常见，仅纯母 乳喂养的1 号婴儿1 月时比例较高（达33%）， 此后有所下降，所有婴儿生后3 d 的粪便中几乎不 含双歧杆菌科，虽然随着日龄和饮食结构复杂化 而出现，但一直没有超过10%；而毛螺旋菌科则 仅出现在奶粉或混合喂养的3 例婴儿粪便中，母 乳喂养的2 例婴儿粪便中未超过1%。 2.3　多样性分析

从表 2 可以看出，各α 多样性值中前4 个值 随着日龄而增加，而Simpson 指数随之减少，说明 粪便中菌群多样性随着日龄而增加，物种越来越 丰富。 3　讨论

本研究对5 例婴儿17 份粪便样本进行了16S rDNA 的V6 高变区新一代高通量测序及分析，表 明该技术能够全面分析婴儿肠道菌群的构成。以 Illumina 为测序平台的宏基因组测序技术以边合成 边测序为原理，可以一次性对几十万至几百万条 DNA 分子进行序列测定，在研究人类肠道宏基因 组方面发挥着重要作用^{[2, 3, 6]}。16S rRNA 是细菌进 化以及分类研究最常用的靶分子，其基因序列（即 16S rDNA）的变化非常缓慢，可以用来标记生物 进化距离和亲缘关系，由于肠道微生物中绝大部 分为细菌，16S rDNA 宏基因测序技术能够满足肠 道宏基因组的研究。本研究表明，新生儿出生不 久肠道中即包含了丰富的细菌基因组。

国外有关肠道宏基因组的研究表明，欧美健 康成人及1~6 岁健康儿童肠道菌门以厚壁菌门和 拟杆菌门占优势^{[1, 10, 11]}。国内研究不多，东北农业 大学Fan 等^[6] 采用与本研究相同的技术对生后1~6 个月内24 份北方婴儿粪便细菌DNA 的测序表明， 与欧美不同，所有样本均以厚壁菌门和变形菌门为优势菌门；以肠杆菌科为优势菌科，但在母乳 喂养婴儿粪便中的含量明显低于人工喂养及混合 喂养婴儿。本研究中剖宫产出生、混合或人工喂 养、母亲产后应用抗生素的3~5 号婴儿1 岁以内 也以厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，而阴道分 娩、纯母乳喂养、母亲未使用抗生素的1 号婴儿 肠道则以拟杆菌门和变形菌门为优势菌门，且一 直持续至生后6 个月，双歧杆菌科比例也是最高的； 同样为阴道分娩、纯母乳喂养的2 号婴儿肠道菌 群则与3~5 号婴儿类似，且持续至生后6 个月， 可能与母亲产后使用抗生素或其他围产期因素有 关。以上研究表明，婴儿肠道菌群的形成可能受 分娩方式、喂养、母亲围产期因素、甚至地域环 境等综合影响，中国婴儿甚至南北不同地域的婴 儿可能有其独特的菌群模式，但这些结论还需要 大样本、多地域人群的连续研究来证实。

Fan 等^[6] 的研究仅有一个时间点，而本研究 显示，婴儿粪便中细菌的丰度及多样性随时间而 增加，提示随着饮食结构的复杂以及活动范围的 扩展，婴儿肠道菌群结构趋向复杂和多样。但值 得注意的是，出生不久即定植的菌群，1 岁以内可 能会一直存在，不同个体之间的菌群组成虽有明 显差异，而同一个体不同时段优势菌群构成相似， 表现出独特的个体特征，说明生命早期的因素如 生产方式、母亲用抗生素等可能会影响1 岁以内 甚至儿童、成人期的肠道菌群结构。

总之，本研究表明婴儿粪便中细菌物种丰度 及分类存在个体差异；从出生到1 岁，粪便中细 菌丰度及多样性随时间而增加，表明肠道菌群结 构趋向复杂和多样；在物种分类方面，不同个体 之间的菌群组成有明显差异，而同一个体不同时 段优势菌群构成相似，表现出独特的个体特征。 本研究的不足之处是样本数少，难以代表所有婴 儿肠道宏基因组特征，未来可行大样本、分组研究。