支气管哮喘(简称哮喘)是淋巴细胞、嗜酸 性粒细胞和肥大细胞等多种炎性细胞及细胞因子 参与的一种慢性呼吸道炎症，目前发病机制尚不 完全清楚。随着人们对 T 淋巴细胞及其相关细胞 因子研究的不断深入及炎症因子诱导 T 细胞分化 机制的进一步阐明，调控气道 T 淋巴细胞失衡及 相关炎症因子表达将是哮喘防治的一个重要方向。 有研究发现，CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺调节性T 细胞(Treg) 能够抑制免疫，在维持 Th1/Th2 平衡中具有重要作 用；而 IL-33 是能够增加 Th2 分泌的细胞因子，在 诱导哮喘发病中的作用亦不可或缺^[1,2]。目前关于 Treg 与儿童支气管哮喘之间关系的研究刚刚起步， IL-33 在哮喘方面的研究亦较少，关于两者是如何 相互作用的将是我们进一步研究的内容之一。故 本研究拟对 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 及 IL-33 在控制 哮喘免疫应答中的调节机制进行探索，以期找到 控制哮喘的新途径。 1　资料与方法 1.1　研究对象

选取2010年10月至2011年3月在我院呼吸 内科门诊就诊的哮喘急性发作期患儿 45 例和因呼 吸道合胞病毒(RSV)感染致喘息的患儿 50 例为 研究对象。哮喘组男 25 例，女 20 例，年龄范围 1~12 岁，中位年龄 4.1 岁，未予激素及其他治疗， 近期无 RSV 感染(血清 RSV-IgM 阴性)；喘息组 男 24 例，女 26 例，年龄范围 1~11 岁，中位年龄 4.2 岁，均为首次发病，所有患儿明确为 RSV 近期 感染(血清 RSV-IgM 阳性，RSV-IgG 阴性)，且 均未合并腺病毒、巨细胞病毒及肺炎支原体的近 期感染。以上两组患儿均为足月适龄儿，无产伤 及窒息史，排除先天性心脏病、心肺发育不全及 免疫缺陷等其他疾病，诊断标准参照《诸福棠实 用儿科学》(第 7 版)。另选取同期在我院儿童 保健科门诊行健康体检的儿童 40 例作为健康对照 组，其中男 20 例，女 20 例，年龄范围 3~10 岁， 中位年龄 4.0 岁，该组儿童近两周内无呼吸道感染 病史及服药史，无过敏性疾病及其他慢性疾病史， 家族内无过敏及哮喘史。 1.2　标本的采集

采集各组儿童的肝素锂抗凝外周血 2 mL， 提取外周血单核细胞(PBMC)，一半用于流式 细胞仪检测，另一半用于 RT-PCR 检测。另采集 分离胶促凝外周血2 mL，室温静置30 min 后， 1 700 r/min 离心 5 min，取上清于 0.5 mL 离心管中， 储存于 -70℃冰箱中待用。 1.3　流式细胞仪检测

用 200 µL PBS 重 悬 并 调 节 PBMC 浓 度 为 1×10 ⁷ /mL。 取 100 µL细胞悬液，加入20 µL  CD4-FITC 和 20 µL CD25-APC 单 克 隆 抗 体(BD  Pharmingen 公司，美国)，避光反应 20 min；加入 2 mL PBS，250 g 离心 10 min，弃上清；加 2 mL 固 定液(BD Pharmingen 公司)，避光反应 10 min； 500 g 离 心 5 min，弃 上 清； 加 入 2 mL PBS， 500 g 离心 5 min，弃上清；加 0.5 mL 破膜剂(BD  Pharmingen 公司)，避光反应 30 min；加入 2 mL  PBS，500 g 离心 5 min，弃上清；重复洗涤 1 次； 加 20 µL Foxp3-PE(BD Pharmingen 公司)，避光 反应 30 min；加入 2 mL PBS，500 g 离心 5 min， 弃上清；加入适量 PBS 后上流式细胞仪检测。 1.4　RT-PCR 检测

取3×10 ⁶  PBMC 细胞，根据说明书用 TRIzol 提取总RNA，定量后取1 µg RNA，DNA 酶 I 处 理 后 逆 转 录，取 cDNA  产 物 4 µL 进 行 PCR。 扩增引物由上海生工生物科技有限公司设计合成， 目的基因 Foxp3 上游引物：5'-CAGCACATTCCCAGAGTTCCTC-3'，下游引物：5'-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC-3'，片段长度 154 bp；内参基因β-actin 上 游 引 物：5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'， 下 游 引 物：5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'， 片段长度 106 bp。PCR 反应体系(25 µL)：PCR  buffer 2.5 µL，dNTP 2.0 µL，Mg ²⁺ 1.5 µL，cDNA  1 µL，上下游引物各0.5 µL，Taq 酶 0.2 µL，加 灭菌水至 25 µL。PCR 反应条件： 95℃预变性 3  min；95℃ 变性 30 s，68℃ 退火 30 s，72℃延伸  60 s，共 40 个循环；72℃再延伸 10 min。PCR 产 物于 2% 琼脂糖凝胶上进行电泳，结果以目的基 因 Foxp3 与内参基因β-actin 的吸光度值比表示。 1.5　ELISA 检测

采用ELISA法检测各组血清IFN-γ、 IL-4、IL-5和IL-33 水 平，试 剂 盒 均 购 自 Bender  MedSystems 公司(奥地利)。所有步骤严格按照 说明书执行。 1.6　统计学分析 采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学 分析。符合正态分布的计量资料以均数 ± 标准差 (x±s)表示，多组间比较采用方差分析；采用 Pearson 相关系数法进行相关性分析。P<0.05 为差 异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组 T 淋巴细胞亚群比例比较

哮喘组 CD4⁺ 、CD4⁺ CD25⁺ 、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 细胞百分比均低于喘息组及对照组(P<0.05)； 喘 息 组 CD4⁺ 细胞百分比高于对照组，而 CD4 ⁺ CD25⁺ 和 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺Treg 细胞百分比均 低于对照组(P<0.05)。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组 T 淋巴细胞亚群比例比较(x±s，%)

表 1 各组 T 淋巴细胞亚群比例比较(x±s，%)

各组外周血 IFN-γ和IL-4 浓度比较差异均无 统计学意义(P>0.05)；哮喘组 IL-33 和 IL-5 水平 均高于喘息组和对照组(P<0.05)，但喘息组和对 照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组外周血细胞因子浓度比较(x±s，pg/mL)

表 2 各组外周血细胞因子浓度比较(x±s，pg/mL)

哮喘组患儿体内CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺Treg 与 IL-4、IL-5水平呈负相关(分别r=-0.325、 -0.287，均P<0.01)，IL-33 水 平 与 IL-4、IL-5 呈正相关(分别r=0.214、0.158，均P<0.01)， CD4 ⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 与 IL-33 呈负相关(r=-0.156， P<0.01)。

喘息组患儿体内CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺Treg 与 IL-4、IL-5水平呈负相关(分别r=-0.205、 -0.160，均P<0.05)，IL-33 水平与 IL-4、IL-5无 明显相关性(P均 >0.05)，CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 与 IL-33 亦无明显相关性(P>0.05)。 3　讨论

支气管哮喘在儿童中的发病率日趋增高， 70%~80% 的儿童哮喘发病于 5 岁以前，约 20% 的 患儿有家族史、特应性体质。随着对过敏性疾病 和 T 细胞研究的深入，单纯的 Th1/Th2 平衡并不 足以解释过敏性哮喘的发病^[3]，尚应考虑 Treg 与 Th1/Th2 失衡的关系。

Treg 是一类调节或抑制其它免疫细胞功能的 细胞，在支气管哮喘中的重要作用得到逐渐认识， 在多种免疫性疾病中发挥重要作用。Foxp3 作为一 特殊的转录因子特异地高表达于 CD4⁺ CD25⁺ Treg 上，可反映 CD4⁺ CD25⁺Treg 活性水平 ^[4]。在本研究 中，哮喘组 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺Treg 比例较对照组及 喘息组低，喘息组较对照组稍低，由此可以说明 喘息的发作机制可能与 Treg 含量降低有关。而哮 喘组患儿体内 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 与 IL-4、IL-5 水平呈负相关，由此可见，Treg 作为具有调节功 能的 T 细胞，有降低 Th2 型细胞因子的作用。可 以推测， Treg 表达降低将引起 Th1 型细胞因子分 泌减少，Th2 型细胞因子分泌增多，导致 Th1/Th2 比例失衡，诱发哮喘。RSV 感染引起的喘息患儿 体内 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 与 IL-4、IL-5 水平亦呈 负相关，且 Treg 表达降低，但不如哮喘组明显， 说明病毒感染诱发的喘息在发病方面与哮喘具有 共同机制。

另哮喘的发病和诸多免疫细胞、众多细胞因 子、多种生物介质以及遗传因素有关^[5] 。IL-33 是 近年来受到广泛重视的具有多种生物学功能的细 胞因子，为 IL-1 家族新成员，能调节 Th2 的分化 与功能^[6] 。IL-33 的受体 ST2 选择性地在 Th2 细胞 上表达，而在 Th1 上不表达。IL-33 能通过主动募 集 Th2 细胞到炎症位点，而使 IL-33 在维持慢性炎 症中起关键的作用^[7]。在体外实验中发现，重组 人 IL-33 与 Th2 细胞孵育能增加 Th2 细胞产生 IL-4 和 IL-5，而与 Th1 细胞孵育能降低 Th1 细胞产生 IFN-γ 的水平^[8] 。本研究结果得知，哮喘组 IL-33 浓度明显高于对照组，哮喘组患儿体内 IL-33 水平 与 IL-4、IL-5 呈正相关，由此可知，哮喘发病可能 亦与 IL-33 水平增高有关，IL-33 引起 Th2 型细胞 因子如 IL-4、IL-5 分泌增多，引起哮喘发病。RSV 感染引起的喘息患儿中 IL-33 水平较对照组并无明 显改变，且相关性分析显示 IL-33 与 IL-4、IL-5无 明显相关性，提示病毒感染引起的喘息中 IL-33 作 用较小，或者 IL-33 作用被中和。

由此引出本文的猜测，IL-33 与 Treg 之间是否 有相互作用而诱导哮喘的发病？

目前对于 IL-33 的研究较多的是类风湿性关节 炎、溃疡性结肠炎感染、心血管疾病、糖尿病、 肿瘤等^[9]。在哮喘和过敏反应的动物实验和体外研 究中证实，减弱 IL-33 的分泌可以减轻疾病相关症 状^[10] 。关于哮喘患者外周血 IL-33 变化的临床研 究不多，麻晓燕等^[11] 对哮喘患者外周血及痰液中 IL-33 分析后发现，哮喘患者的 IL-33 显著升高， 与本研究结果相符。

本 研 究 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 与 IL-33 的 相 关性分析显示，哮喘组 Treg 比例与 IL-33 呈负相 关，那么它们是如何相互作用的有待进一步研究。 Ayyoub 等 ^[12] 的研究结果表明，较高浓度的 IL-1可 与 IL-2 协同，诱导 Treg 细胞转化为 Th17 细胞， 并且下调 Treg 细胞的 Foxp3 表达和抑制功能，由 此我们猜测作为 IL-1 家族成员的 IL-33 可能通过 影响 Treg 分化，从而诱发哮喘。

综上所述，哮喘发病与 Treg 表达降低有关， Treg 表达降低可引起 Th1 型细胞因子分泌减少， Th2 型细胞因子分泌增多，导致 Th1/Th2 比例失衡， 诱发哮喘。RSV 感染诱发的喘息在 Treg 发病方面 与哮喘具有共同机制。哮喘发病亦与 IL-33 水平增 高有关，IL-33 引起 Th2 型细胞因子如 IL-4、IL-5 分泌增多，引起哮喘发病。病毒感染引起的喘息 中 IL-33 作用较小，或者 IL-33 作用被中和。哮喘 患儿体内 Treg 比例与 IL-33 呈负相关，说明二者 在诱发哮喘方面确有相互关系，猜测作为 IL-1家 族成员的 IL-33 可能通过影响 Treg 分化，从而诱 发哮喘。它们是如何相互作用的有待进一步研究。

志谢：感谢无锡市人民医院检验科张健老师 在收集标本中给予的帮助。感谢无锡市人民医院 中心实验室穆会君老师、殷莹老师等在本实验中 给予的悉心指导。感谢邢朝凤、潘姗姗学妹在实 验过程中给予的帮助。