支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞和炎 性介质共同参与的一种慢性气道炎性高反应性疾 病。其确切发病机制尚未阐明，研究表明免疫调 节功能异常为哮喘发病的主要因素^[1]。滤泡样辅助 性 T 细胞（follicular T helper cells, Tfh 细胞）是近 年来发现的效应性 CD4⁺ T 细胞亚群，在促进 B 细 胞增殖及分化、产生免疫球蛋白以及类别转换等免 疫调控过程中具有重要作用^[2,3]。Tfh 细胞的产生和 分化受多种因素影响，如转录调控因子 BLIMP-1、 BCL-6、PD-1 等，局部微环境细胞因子也可影响 Tfh 细胞分化 ^[3]。目前多种免疫功能紊乱性疾病如 系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、川崎病等患者 发现其外周血 Tfh 细胞数量或功能异常^[4,5,6]。目前 尚无哮喘患儿 Tfh 细胞及其转录调控因子的研究， 因此本研究通过观察哮喘患儿外周血 Tfh 细胞的变 化，为探讨哮喘的免疫发病机制提供新思路。 1　资料与方法 1.1　研究对象

选取2012年7月至2013年12月在我院呼吸 科住院或门诊治疗的哮喘患儿 64 例为研究对象， 所有患儿均根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指 南》（2008 年版）^[7] 确诊，依据病情将哮喘患儿 分为哮喘急性期组和哮喘缓解期组。急性期组患儿 36 例，均初诊为哮喘或缓解后复发，其中男 19 例， 女 17 例，平均年龄 4.1±2.8 岁；缓解期组 28 例， 均为药物治疗后哮喘症状及体征消失并持续 3 个 月以上无发作者，其中男 15 例，女 13 例，平均 年龄 4.8±3.2 岁；同期选取在我院行健康体检儿 童 25 例为对照组，其中男 15 例，女 10 例，平均 年龄 4.5±1.6 岁。所有患儿标本采集前 3 个月内 均未应用糖皮质激素以及其他免疫抑制剂或免疫 调节剂等；对照组儿童除外过敏性疾病、自身免 疫炎性疾病等病史。本研究经医院伦理委员会批 准通过，并获得患儿家长知情同意。 1.2　标本采集

急性期哮喘患儿在用药治疗前，缓解期患儿 在用药治疗后3 个月，对照组儿童于行健康体检时， 分别空腹采集外周静脉血 2~3 mL，肝素钠抗凝。 各组分别取 300 μL 全血用于流式细胞分析；余全 血行 300 G/min 离心 10 min，提取上层血浆，-80℃ 保存，待用于检测血浆细胞因子及 IgE 水平；余血 细胞加入等体积 PBS 液混匀后，采用 Ficoll 密度 梯度离心法，分离出外周血单个核细胞（PBMC）， 稀释混匀后用于检测 BCL-6 和 BLIMP-1 mRNA 水 平。 1.3　流式细胞术检测外周血 CD4⁺ CXCR5⁺Tfh 细 胞

全血法配制流式上机分析液，注入人丙种球 蛋白（10 μg）室温封闭 15 min；分别加入 FITC 标 记 CD4 单克隆抗体（美国 Beckman 公司）、PE 标 记 CXCR5 单克隆抗体（美国 R.D 公司），室温避 光染色 30 min；所有操作严格按照说明书进行， 分析液 4℃保存，并在 2 h 内上流式细胞仪（美国 Beckman 公司，Epics-XL4）检测。设同型对照， 阴性表达控制在 2% 以内。流式细胞检测数据结果 用 EXPRO32 ADC 软件分析。 1.4　实时荧光定量 PCR 检测 BCL-6 和 BLIMP-1 mRNA 表达水平

取已分离的PBMC 细胞悬液，免疫磁珠法 分 离 CD4⁺T 细 胞； 按 试 剂 盒（Ambion 公 司， AM1912）说明书步骤提取总 RNA，逆转录合成 cDNA。根据 Genebank 设计引物，BCL-6 引物序列： 上游引物：5'-ATGAGGAGTTTCGGGATGTC-3'，下 游 引 物：5'-CCTCTTCTGGGATTGTTTCC-3'，片 段 长度 177 bp；BLIMP-1 引物序列：上游引物：5'-GGCTACAAGACCCTTCCCTAC-3'； 下游引物：5-TCAGGTGGACCTTCAGATTGG-3' ，片段长度 132 bp； β-actin 引物序列：上游引物：5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，下游引物：5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'，片段长度 120 bp，所有引物由上海 英骏（invitrogen）公司合成。反应体系（20 μL）： SYBR 8 μL，目的基因上下游引物各 1 μL，β-actin  上下游引物各 1 μL，cDNA 3 μL，灭菌水 5 μL。反 应条件：95℃ 预变性 30 s；95℃ 变性 10 s，56℃  退火 10 s，72℃延伸 15 s，共进行 40 个循环；最 后 72℃延伸 60 s。产物于 2% 琼脂糖凝胶上，以 90 V 电泳 30 min 后回收纯化，送上海 invitrogen 公 司测序，结果与 Genebank 中目的基因 mRNA 序列 一致。应用 Relative Quantification 模式进行数据分 析，结果以目的基因 /β-actin 比值表示。 1.5　酶联免疫吸附试验检测细胞因子及 IgE 水平

取已分离 -80℃冰冻血浆，4℃解冻。双抗夹 心 ELISA 法 检 测 血 浆 总 IgE、IL-2、IL-6 、IL-21 浓度水平，操作步骤详见说明书，所有 ELISA 试 剂盒购自 Bender 公司。 1.6　统计学分析

采用 SPSS 14.0 统计软件包对数据进行统计学 分析，正态分布计量资料以均数 ± 标准差（x±s） 表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间 两两比较行 SNK-q检验；Pearson 相关系数法用于 相关性分析，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组患儿外周血 CD4⁺ CXCR5⁺Tfh 细胞水平 比较

流式细胞仪检测到急性期哮喘患儿外周血 CD4⁺ CXCR5⁺ Tfh 细 胞 水 平 为 18%±8%，明 显 高于健康对照组（10%±4%）和哮喘缓解期组 （10%±5%）（P<0.05），缓解期组和对照组比 较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1。

图 1　　流式细胞仪检测各组 CD4+ CXCR5+Tfh 细胞水平 光散射和 CD4+ 细胞联合设门，检测 CD4+细胞群内 CXCR5+ 阳性细胞比例，即 CD4+ CXCR5+Tfh 细胞比例（右上象限内）。

急性期组患儿 BCL-6 mRNA 表达水平高于健 康对照组和缓解期组（P<0.05），缓解期组与对照 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；急性期组患 儿 BLIMP-1 mRNA 表达水平明显低于对照组和缓 解期组（P<0.05），缓解期组与对照组比较差异无 统计学意义（P>0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1　各 组 CD4+ CXCR5+ Tfh 细 胞 BCL-6 和 BLIMP-1 mRNA 表达水平比较　（x±s）

表 1 各 组 CD4+ CXCR5+ Tfh 细 胞 BCL-6 和 BLIMP-1 mRNA 表达水平比较　（x±s）

急性期组和缓解期组患儿血浆 IL-6 水平差 异无统计学意义（P>0.05），但均高于对照组 （P<0.05）；急性期组患儿血浆IL-21 和 总 IgE 水平显著高于对照组和缓解期组（P<0.05），而 IL-21 和总 IgE 水平在对照组和缓解期组间差异无 统计学意义（P>0.05）；急性期组患儿血浆 IL-2 水平显著低于对照组和缓解期组（P<0.05），而 IL-2 水平在对照组和缓解期组间差异无统计学意 义（P>0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2　各组血浆细胞因子及 IgE 水平比较　（x±s）

表 2 各组血浆细胞因子及 IgE 水平比较　（x±s）

相关性分析显示，急性期组患儿 CD4⁺ CXCR5⁺  Tfh 细胞数量与血浆总 IgE 和 IL-21 水平呈正相关 （分别r=0.71、0.76，均P<0.05）；而 IL-6 水平 与CD4⁺ CXCR5⁺ Tfh 细胞数量相关系数较弱（r=0.46， P<0.05）；血浆 IL-2 水平与 CD4⁺ CXCR5⁺Tfh 细胞 数量呈明显负相关（r=-0.68， P<0.05）。 3　讨论

支气管哮喘是多细胞、多炎性介质参与的一 种气道慢性炎症性疾病^[8]，确切病因及发病机制迄 今尚未完全阐明。资料证实 Th1/Th2 细胞失衡、 Treg 及Th17 细胞异常、血IgE 增高等均参与其发病， 提示免疫功能紊乱是哮喘发病的主要因素^[9,10,11]。研 究发现，IgE 增高与哮喘的触发有关，亦与哮喘发 作的严重程度相关^[12]，表明哮喘本质为 IgE 介导 的速发型变态反应和气道慢性炎症所致气道高反 应性疾病。Tfh 细胞为近年来新发现的效应性 T 细 胞亚群，主要参与诱导并激活生发中心 B 细胞增 殖、分化为浆细胞，以及产生免疫球蛋白及其类 别的转换（IgG、IgM、IgE 等）过程^[3,13]。近年来 的研究发现，多种自身免疫性疾病如风湿性关节 炎^[5,14]、川崎病^[6]、自身免疫性甲状腺炎^[15]、糖尿 病^[16]、血小板减少性紫癜^[17] 等均发现有 Tfh 细胞 存在异常分化，且 Tfh 细胞增高程度与系统性红斑 狼疮（SLE）的严重程度密切相关^[4]。成人哮喘研 究结果也显示外周血 CD4⁺ CXCR5⁺Tfh 细胞数量增 加^[18]。然而有关儿童支气管哮喘Tfh 细胞数量变化， 以及影响 Tfh 细胞分化的调控因素，未见文献报道。

本研究发现急性期哮喘患儿外周血 CD4⁺ CXCR5⁺Tfh 细胞水平明显高于健康对照组， 并在哮喘缓解期降低，这与已有文献结果相一 致^[18]，提示外周血 Tfh 细胞数量增加参与了哮喘 的发病过程。Tfh 细胞为辅助 B 细胞生成抗体的主 要亚群细胞，且在免疫球蛋白类别的转换（IgG、 IgM、IgE 等）过程具有重要的作用 ^[13]。文献资料 显示，SLE 患者外周血 Tfh 细胞比例增高，且与自 身抗体滴度呈正相关^[4] ，风湿性关节炎患者血 Tfh 细胞数量与疾病活动性以及抗-CCP 抗体水平密切 相关^[14] ，表明 Tfh 细胞病理性增多，通过促进 B 细胞成熟转化为浆细胞，参与疾病状态下自身抗 体的产生。哮喘急性发作的本质为 IgE 介导的速发 型超敏反应所致的气道痉挛， IgE 增高与哮喘的触 发有关，其抗体滴定度与哮喘发作的严重程度密 切相关^[12]。因此本研究分析 Tfh 细胞数量与哮喘 患儿血浆总 IgE 浓度相关性，结果显示哮喘患儿血 Tfh 细胞增高与血浆IgE 水平有很高相关性（r=0.71， P<0.05），推测哮喘患儿增多的 Tfh 细胞可能是通 过诱导 IgE 产生从而参与哮喘的急性发病过程。

转录调控因子BCL-6 和 BLIMP-1是调控 原始 CD4⁺T 细胞向Tfh 细胞分化的重要调控因 素^[3,19,20] 。已知 BCL-6 为促转录因子，可通过上调 CD4⁺ T 细 胞 CXCR5、PD-1、ICOS 等 的 表 达 ^[19]， 促使原始T 细胞分化为Tfh 细胞，而过表达的 BLIMP-1、PD-1 可抑制 Tfh 细胞产生 ^[20] 。BLIMP-1 为 Tfh 细胞的转录抑制因子，主要通过抑制 BCL-6  mRNA 等的表达，间接抑制初始 T 细胞向 Tfh 细胞 的分化^[19] 。本研究进一步观察 BCL-6 及 BLIMP-1  mRNA 表达水平，结果显示哮喘急性期患儿 BCL-6  mRNA 表达水平明显高于健康对照组，而 BLIMP-1  mRNA 表达量较对照组明显降低，且BCL-6和 BLIMP-1 的异常表达在哮喘缓解期恢复正常，提 示哮喘急性期患儿外周血促转录因子 BCL-6 mRNA 表达上调、转录抑制因子BLIMP-1 mRNA表达下调， 促使原始 T 细胞分化为 Tfh 细胞。哮喘患儿 BCL-6 及 BLIMP-1 mRNA 的异常表达，进一步支持哮喘 患儿体内存在 Tfh 细胞的异常分化。

局部微环境细胞因子浓度的改变也可影响 Tfh 细胞分化，其中IL-2、IL-6、IL-21 是影响 Tfh 细 胞的最主要因子^[3,13,14] 。IL-6 和（或）IL-21 等增 加 Tfh 细胞转化，成熟 Tfh 细胞又可分泌 IL-21 等 细胞因子，继续促进原始 T 细胞向 Tfh 细胞的转 化，形成正反馈环路^[3] 。而 IL-2 可抑制 Tfh 细胞分 化。本研究结果显示，哮喘患儿急性发作期血浆 IL-6及IL-21 水平显著增高，IL-2 浓度水平明显低 于健康对照组及缓解期组，相关性分析结果显示 IL-21、IL-6 都与 Tfh 细胞数量呈正相关，而 IL-2 与 Tfh 细胞数量呈负相关，提示哮喘患儿血 IL-6、 IL-21 以及 IL-2 参与 Tfh 细胞数量异常的调控。这 些细胞因子是直接影响 Tfh 细胞转化或是通过转录 调控因子 BCL-6、BLIMP-1 的表达间接调控 Tfh 细 胞的分化，有待进一步的实验证实。

综上所述，儿童哮喘急性发作期外周血中 CD4⁺ CXCR5⁺Tfh 细胞数量增加，且与 IgE 浓度呈 正相关，提示 Tfh 细胞的异常分化可能参与了儿童 哮喘的急性发病过程；转录调控因子 BCL-6 mRNA 表达上调及 BLIMP-1 mRNA 表达下调可能参与了 哮喘患儿 Tfh 细胞异常分化的调控；Tfh 细胞异 常分化的调控还可能与微环境中细胞因子 IL-6、 IL-21 和 IL-2 浓度改变有关。