急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病（acute lymphoblastic  leukemia, ALL）是一种常见的血液系统恶性肿瘤性 疾病，儿童是其主要发病人群，约占 80%，对儿 童的健康和生命造成了极大的危害。近年来，儿 童 ALL 的治疗取得了显著进步，治疗后 5 年无事 件生存率可达 70%~90%。尽管如此，仍约有 20% 的 ALL 患儿会发生复发，复发是导致治疗失败、 儿童死亡的一个重要原因^[1]。研究表明，部分经 治疗后达到形态学完全缓解（complete remission,  CR）的 ALL 患儿，体内仍然存在有一定量的 ALL 细胞负荷，即微小残留病（minimal residual disease,  MRD），是导致 ALL 复发的主要原因 ^[2,3,4]。流式细 胞技术是目前临床 MRD 检测最为常用的方法，但 是需要多抗体联合标记，方法尚未形成标准化的 操作流程，且因为抗体组合模板呈现多样化，各 临床实验室根据自身需要和研究结果采用了不同 的用于区分正常造血细胞和ALL 细胞的抗体模板。 本研究采用回顾性队列研究的方法，初步评估我 院目前应用于流式细胞术分析的 4 色荧光标记抗 体组合模板对儿童B-ALL 治疗后MRD 的检测价值， 明确现有 MRD 检测结果对儿童 B-ALL 的临床意义 和预后判断价值。 1　资料与方法 1.1　研究对象

选取2010年10月至2012年3月期间于我院 就诊，并在治疗达到 CR 后进行 MRD 检测的 B-ALL 患儿为研究对象，所有患儿均经形态学、免疫分 型及分子遗传学确诊，剔除治疗不完整或在外院 接受过化疗的患儿。收集患儿的相关临床资料， 包括人口统计学特征、ALL 初诊时间、治疗方案、 治疗结果、骨髓形态学结果、免疫分型结果、分 子遗传学结果、MRD 检测结果等。

本研究共纳入B-ALL 患儿 183 例，其中男 122 例，女 61 例；平均发病年龄为 5±4 岁，其中 <1 岁 5 例，1 岁 ~ 133 例，≥ 10 岁 45 例；发病时 WBC 计数平均为 32.4×10 ⁹ /L（0.3~360.9×10 ⁹/L）， 其中≥ 50×109/L 的患儿有 27 例；在 FAB 分型中， L1、L2 和 L3 型的患儿分别为 94、80、9 例；融 合基因阳性者有 46 例，其中检测出 BCR-ABL 和 MLL-AF4 的分别为 8 例和 6 例；初诊后进入标危、 中危和高危治疗方案的患儿分别为 98、55 和 30 例。 1.2　分组及随访

根据 MRD 检测的时间及检测的结果，将所 有纳入的研究对象分为：（1）诱导缓解期 MRD 阴性组：在诱导缓解期末（第 33 天）检测 MRD 且 MRD<0.01%；（2） 诱 导 缓 解 期 MRD 阳 性 组：在诱导缓解期末（第33 天）检测MRD 且 MRD ≥ 0.01%；（3）维持治疗期 MRD 阴性组： 在维持治疗期检测 MRD 且 MRD<0.01%；（4）维 持治疗期 MRD 阳性组：在维持治疗期检测 MRD 且 MRD ≥ 0.01%。

根据 MRD 检测时间，对患儿制定不同的随访 期：在诱导缓解期检测 MRD 的患儿，应自初诊时 起随访 1 年；在维持治疗期检测 MRD 的患儿，应 自初诊时起随访 3 年。以出现以下标准之一者作 为ALL 复发的诊断标准：（1）骨髓幼稚淋巴细胞（原 始淋巴细胞 + 幼稚淋巴细胞）>5% 但≤ 20%，经 过有效的抗白血病治疗仍然不能达到骨髓像 CR 者；（2）骨髓幼稚淋巴细胞（原始淋巴细胞 + 幼 稚淋巴细胞）>20% 者；（3）有骨髓外白血病细 胞浸润者。 1.3　MRD 检测

所有患儿取EDTA-K抗凝骨髓或外周血 2~3 mL，常规分离有核细胞，按照抗体模板组合（表 1）在 BD FALCON 流式管中加入抗体和 100 μL 抗凝全血，充分混匀，避光15 min，离心后加 500 mL PBS 混匀细胞，利用 FACS Calibur 流式细 胞分析仪（BD 公司，美国）进行幼稚细胞 MRD 的检测。

表 1(Table 1)

表 1 MRD 检测多抗体组合模板

表 1 MRD 检测多抗体组合模板

所有患儿取肝素或 EDTA-K 抗凝骨髓 2~3 mL， 常 规 分 离 有 核 细 胞，以 CD19、CD10、CD20、 CD22、CD79a、CD38、CD2、CD3、CD5、CD7、 CD4、CD8、CD56、CD34、CD117、HLA-DR、 CyTdT 抗体对有核细胞进行标记，利用 FACS Calibur 流式细胞分析仪进行幼稚细胞免疫表型的检测。 1.5　统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件对结果进行统计学分 析。正态分布计量资料用均数 ± 标准差（x±s）表 示，非正态分布计量资料用中位数（四分位间距）[P50 （P25，P75）] 表示。计数资料采用百分率（%）表示， 多组比较采用χ²或校正χ²检验或 Fisher 确切概率法。 采用生存分析模型对患儿累积复发率进行比较分析。 利用 Cox 风险比例回归模型，对可能的复发相关因 素进行多因素分析。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组患儿临床及生物学特征对比分析

183 例患儿中，55 例（30.1%）患儿在诱导 缓 解 期 末（ 第 33 天） 进 行 MRD 检 测，128 例 （69.9%）患儿在维持治疗期进行 MRD 检测。以 MRD ≥ 0.01% 作为阳性界值，共有 33 例（18.0%） 患儿 MRD 检测结果为阳性，其中诱导缓解期末 18 例（32.7%），维持治疗期 15 例（11.7%）。统 计分析结果显示，对于诱导缓解期末和维持治疗 期的患儿，MRD 阳性组中高危和中危分级的比例 明显高于 MRD 阴性组（P<0.05）；而对于初诊年龄、 性别、初诊 WBC 计数、FAB 分型和融合基因等其 他临床特征，在诱导缓解期末和维持治疗期患儿 中，MRD 阳性和阴性组之间差异均无统计学意义 （均P>0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2不同 MRD 水平的 B-ALL 患儿临床及生物学特征[例（%）]

表 2 不同 MRD 水平的 B-ALL 患儿临床及生物学特征[例（%）]

183 例患儿中，共有21 例在随访期内发生复发， 包括骨髓复发 16 例，髓外（中枢神经系统、睾丸） 复发5 例。诱导缓解期末MRD 阴性和阳性组患儿中， 各有 3 例患儿在 1 年内复发，其 1 年累积复发率分 别为 8%±5% 和 13%±9%，利用生存分析模型对 两组患儿进行累积复发率的比较，结果显示差异 无统计学意义（χ²=1.090，P=0.296）。维持治疗期 MRD 阴性和阳性组患儿中，各有 11 例和 4 例在 3 年内复发，其 3 年累积复发率分别为 11%±3% 和 28%±11%，经生存分析比较后 MRD 阳性组累积复 发率明显高于阴性组（χ²=4.226，P=0.04）。见图 1。

图 1　各组 B-ALL 患儿的累积复发率 左图为诱导缓解期末不同 MRD 水平患儿的累积复发率；右图为维持治疗 期不同 MRD 水平患儿的累积复发率。

Cox 风险比例回归模型用于分析患儿初诊时性 别、年龄、外周血 WBC 计数、形态学 FAB 分型、 融合基因、强的松诱导窗口反应、第 15 天骨髓象 和缓解后 MRD 水平等因素对复发预后的影响。结 果显示对强的松不敏感、第 15 天骨髓象未达 M1 和缓解后 MRD 水平阳性（≥ 0.01%）是儿童 B-ALL 发生复发的高危因素，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3儿童 B-ALL 复发高危因素的 Cox 风险比例回归模型

表 3 儿童 B-ALL 复发高危因素的 Cox 风险比例回归模型

本研究以我院近 3 年内收治的 B-ALL 患儿为 研究对象，分析了现有的 FCM 荧光标记抗体组合 模板对 B-ALL 患儿治疗后 MRD 检测的临床价值。 研究结果表明，我院目前应用于 FCM-MRD 检测的 4 色荧光标记抗体组合模板能够较好的区分化疗后 MRD 阳性和阴性的患儿。治疗后， 应用该方法检 测为 MRD 阳性的患儿，其白血病长期累积复发率 明显高于 MRD 阴性的患儿。在现有治疗方案下， MRD 检测结果、早期强的松反应性及第 15 天骨髓 象等指标，是儿童 B-ALL 重要的治疗评价和预后 判断指标，具有重要的临床检测价值。

ALL 是儿童最为常见的血液系统肿瘤，近年 来逐渐形成并完善的依据患儿个体情况所进行的个 体化治疗，尤其是依据早期治疗反应来调整治疗方 案是提高治疗效果，避免复发、死亡等不良结局的 有效手段，随着研究的深入，越来越多的评价指标 被引入评估体系。基于药物治疗或干细胞移植达 到 CR 后体内残存白血病细胞数量的 MRD 检测自 1975 年首次研究证实以来，受到了广泛的关注，被 多个研究证实是儿童 ALL 预后判断的独立、重要的 指标^[5,6,7]。本研究分析了 183 例诱导缓解后应用多 参数 FCM 进行 MRD 检测的 B-ALL 患儿，研究结果 显示在诱导缓解期组和维持治疗期组中，危险分级 定为高危的患儿在治疗后较中危和标危的患儿更易 出现 MRD 阳性（≥ 0.01%），提示 MRD 与危险度 存在一定的相关性，因此对于高危组的患儿应当适 时的调整和优化其治疗方案，降低 MRD 的阳性率， 减少今后的复发。同时，本研究显示对于初诊年龄、 性别、WBC 计数、FAB 分型及融合基因等临床、 生物学特征，阳性组和阴性组之间没有差异，这与 陈静等^[8] 的结果类似，但 St.Jude 儿童医院 2000 年 的总结资料显示 MRD 阳性的婴儿与 >10 岁的儿童 较 1~10 岁的儿童高^[9]，Jacquy 等^[10] 和 Nyvold 等^[11] 的研究也显示 MRD 的水平与上述因素有一定的相 关性，这可能与研究的样本量不同有关。

MRD 作为一个预后监测指标，已被多个研究 证实能够有效评价白血病的治疗效果及预后。有 研究发现 MRD 阳性组 5 年累积复发率约是阴性组 的 2 倍（28.6% vs 11.8%） ^[12]；德国BFM协作组 的资料显示，MRD 阳性组的 3 年累积复发率较阴 性组高出 5~10 倍（39%~86% vs 3%~15%） ^[8]。本 研究资料显示，对于在诱导缓解期末检测 MRD 的 患儿，其 1 年累积复发率在 MRD 阳性组和阴性组 之间差异无统计学意义（8% vs 13%），而对于在 维持治疗期检测 MRD 的患儿，MRD 阳性组的 3 年累积复发率是 MRD 阴性组的约 2.5 倍（28% vs  11%）。由于本研究所纳入的诱导缓解期末检测 MRD 的患儿只有 1 年随访期，MRD 阳性和阴性组 各有 3 例患儿复发，且 ALL 的复发多发生于疾病 强化治疗后的维持期，因此研究人数相对较少以 及随访时间较短可能是造成诱导缓解期末 MRD 阳 性组和阴性组复发率无明显差别的主要原因。尽 管如此，通过 Cox 风险比例回归模型分析，依然 发现 CR 后 MRD 水平，连同强的松窗口反应以及 治疗第 15 天的骨髓象都是儿童 B-ALL 相关的独立 预后因素。有研究显示，在诱导缓解早期的 MRD 水平较诱导缓解期末和维持治疗期的 MRD 水平对 复发的预后判断价值更大^[13]，但由于本研究为横 断面的研究且两组病例随访时间不同，随访时间 相对较短，因此不能比较在不同时间点检测 MRD 对复发的判断意义，需要在后期进一步延长随访 时间，收集相关资料，以期在后续的研究中明确 MRD 的检测时间点对儿童 ALL 预后判断的价值。

综上所述，我院现有的 MRD 检测模板能够较 好的区分治疗后 MRD 阳性和阴性患者，为患者的 治疗效果提供相应的评价指标，便于临床医生采 取相应的治疗措施。目前，本课题组正在积极建 立可用于 FCM-MRD 分析的 6 色荧光标记抗体组合 模板，以求进一步提高 MRD 检测结果的灵敏度和 准确性。在此基础上，后期本课题组将会对 B-ALL 患儿进行纵向序贯的 MRD 长期随访研究，进而对 FCM 检测系统做出全面的临床评估；同时，通过 比较在化疗不同阶段的 MRD 水平对患儿预后结局 的影响，寻找更为重要的 MRD 检测时间，为临床 提供更为有效的疗效评价和预后判断信息。