随着围产医学的发展，早产儿救治的水平在 不断提高，然而由于早产儿脑发育的不成熟性， 容易出现“早产儿脑病”，导致脑性瘫痪、认知 缺陷等神经系统后遗症^[1]。近年研究表明围产期感 染是导致“早产儿脑病”的重要原因。产前绒毛 膜羊膜炎、胎膜早破等是导致宫内感染的重要原 因，而新生期发生的败血症、脑膜炎及坏死性小 肠结肠炎等是导致生后感染的重要原因^[2,3]。宫内 感染与生后感染对未成熟脑损伤的影响国内外已 经有报道。宫内感染作为“初次打击”，对胎儿 及新生儿脑造成损伤。免疫功能低下的早产儿在 新生儿科救治时容易出现院内感染，出现“二次 打击”^[4]，然而围产期反复感染对未成熟脑损伤的 影响如何，目前未见报道。 本研究在国内外首次 通过新生小鼠围产期反复感染脑损伤动物模型， 探讨髓鞘发育障碍与神经功能障碍的关系，以期 进一步阐述早产儿脑损伤的机制，为今后的预防、 治疗提供新的思路。 1　材料与方法 1.1　实验动物及模型制作

清洁级孕 18 d C57BL/6 小鼠共 6 只，购自斯 莱克实验动物有限公司。所有母鼠随机分为宫内 感染组、围产期反复感染组和对照组。宫内感染 模型制作方法参照文献^[5] ，即给予孕 18 d C57BL/6 母鼠单剂腹腔注射 LPS（0.5 mg/kg）。围产期反复 感染脑损伤模型制作方法参照文献^[6]，即宫内感染 母鼠所生仔鼠在生后第 3~12 天，连续每日固定时 间腹腔注射 1 次 LPS（0.5 mg/kg）。对照组均用等 量生理盐水替代 LPS 在上述相同时间点给予母鼠 和仔鼠腹腔注射。注射结束后，动物放回动物房 饲养。各组仔鼠生后第 3~12 天每日测量体重变化 情况，于生后第 13 天待神经发育检测完成后处死。 1.2　取材

各组仔鼠经水合氯醛麻醉，右心房处剪一切 口，然后用注射器于左心室灌注生理盐水，至流 出液体变清为止。4% 多聚甲醛灌注。取脑后置于 4% 多聚甲醛里 4℃冰箱过夜，梯度蔗糖脱水，脑 组织沉底后称重，将固定脑组织取视交叉水平行 冰冻切片，厚度为 30 μm。脑片放于原位杂交脑保 护液中，-20℃冰箱保存。 1.3　神经病理评估

生后 13 d，每组各取仔鼠 8 只，每只仔鼠取 相同侧脑室层面脑片 1 张，贴片干燥后常规采用 焦油紫染色，评价胼胝体及脑室大小。 1.4　Western blot 检测

生后 13 d，每组各取 6 只仔鼠全脑组织，0.25% 胰酶消化及离心后收集细胞沉淀，蛋白裂解液抽 提细胞蛋白。取上清，BCA 法测蛋白浓度，各孔 加入 100 μg 蛋白样品电泳、转膜，5% 小牛血清封 闭液封闭 1 h，加入肿瘤坏死因子-α多克隆抗体 （TNF-α，1 : 500，Millipore）、半胱氨酸蛋白酶-3 多克隆抗体（Caspase-3，1 : 1 000，CST），髓鞘碱 性蛋白单克隆抗体（MBP，1 : 1 000，Covance）， TBST 洗膜3 次，二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次， ECL 显色，用凝胶成像分析软件测定条带的积分 光密度值（IOD），并计算目的蛋白和内参β-actin 的 IOD 比值，即为相对光密度。 1.5　神经行为发育测定

生后第 13 天，每组 8 只仔鼠分别检测步态 反射、翻正反射和负向趋地反射，每项间隔时间 10 min，重复 4 次，计算各组平均时间，以评价早 期神经行为发育情况；如果动物在规定时间内不 能完成任务，步态反射记录最长时间为 60 s^[7]。 1.6　统计学分析

采用 SPSS 13.0 软件对数据进行统计学分析， 计量资料采用均数 ± 标准差（x±s）表示，多组 比较行单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组体重与脑重变化

各组仔鼠生后 3~12 d 每日监测体重，测定每 日体重增长值，对照组平均每日增重 0.49±0.14 g， 反复感染组平均每日增重 0.40±0.08 g，宫内感 染组平均每日增重 0.41±0.05 g，3 组比较差异无 统计学意义（F=1.38，P>0.05）。 生 后 第 13 天 各组仔鼠处死后，统一称重脑组织，结果表明对 照组、宫内感染组和反复感染组仔鼠脑重分别为 0.35±0.02 g、0.29±0.01 g 和 0.26±0.01 g，差 异 有统计学意义（F=52.16，P<0.01），围产期反复 感染组脑重下降最为明显，与对照组和宫内感染 组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 2.2　神经病理学评估

焦油紫染色进行神经病理学评估。结果显示 宫内感染与反复感染均引起未成熟脑组织萎缩， 具体表现为侧脑室体积扩大，胼胝体厚度变薄、 脑皮质区神经细胞疏松等，反复感染组的上述病 理学改变更为突出，见图 1。

图 1　各组仔鼠生后13 d 脑组织神经病理学评估（焦油紫染色，×10） 与对照组和宫内感染组相比， 反复感染组脑组织胼胝体明显变薄、侧脑室明显扩张、大脑皮质区结构疏松。红色箭头示胼胝体，黑色箭头示 侧脑室，★示脑皮质区。

取各组生后 13 d 仔鼠脑组织，行匀浆后进行 Western blot 检测。结果显示反复感染组 TNF-α和 Caspase-3 表达水平均明显高于对照组和宫内感染 组（均P<0.01）。MBP 标记脑白质髓鞘发育情况， 结果显示反复感染组 MBP 表达水平明显低于对照 组和宫内感染组（P<0.01）。 见表 1，图 2。

表 1(Table 1)

表 1　各组 TNF-α、Caspase-3 和 MBP 表达水平比较

表 1 各组 TNF-α、Caspase-3 和 MBP 表达水平比较

图 Western blot 定量分析围产期反复感染对未成熟脑组织 TNF-α、Caspase-3 和 MBP 表达的影响（n=6） 上图为 Western blot 电泳条带图；下图为统计图，a 示与对照组比较，P<0.05；b 示与宫内感染组比较，P<0.05。

检测生后 13 d 各组仔鼠的步态反射、翻正反 射和负向趋地反射，评估各组早期神经行为发育。 结果显示，不论是步态反射、翻正反射，还是负 向趋地反射，反复感染组完成反射所需时间均明 显长于对照组和宫内感染组（均P<0.01），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2　各组大鼠脑神经行为发育指标比较（x±s，s）

表 2 各组大鼠脑神经行为发育指标比较（x±s，s）

随着围产医学的日益发展，早产儿存活率在 不断增加。早产儿由于脑发育不成熟，容易发生 以脑室周围白质损伤同时伴有灰质神经元及轴突 破坏为特征的“早产儿脑病”，导致神经功能发 育障碍。

国内外研究发现，围产期脑损伤除了与缺氧 缺血关系密切外，感染 / 炎症同样也是重要原因。 围产期感染包括宫内感染与新生儿期感染。宫内 感染又称先天性感染，是由于孕妇在妊娠期出现 绒毛膜羊膜炎及 TORCH 感染等，导致胎儿感染性 脑损伤。虽然目前新生儿尤其早产儿存活率在不 断提高，然而其免疫功能非常不成熟，在新生期 容易感染葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠埃希菌等， 引起败血症、脑膜炎及坏死性小肠结肠炎等各种 问题，导致新生儿期脑损伤^[8,9]。由于未成熟脑对 损伤的敏感因素存在不同程度差异，影像学表现 也各有不同，有的损伤较为轻微，可以恢复到完 全正常，有的损伤较为严重，出现脑性瘫痪、认 知缺陷等神经系统后遗症^[7,10]。究竟是什么原因引 起这些差异，具体机制目前不清，需要深入的研究。

动物实验表明宫内感染与生后感染均是导 致新生儿脑损伤的重要因素。以往利用孕鼠腹腔 注射内毒素，模拟宫内感染，造成脑损伤；生后 2~5 d 小鼠脑发育与 23~32 周早产儿脑内白质发育 大致相当，所以有人采用生后 3 d 新生小鼠开始连 续多日腹腔注射 LPS，模拟新生儿期感染。以上两 种模型均造成炎症因子释放，神经细胞凋亡，神 经行为出现障碍。本研究参考以上文献采用宫内 感染脑损伤模型，模拟胎儿宫内感染受到“初次 打击”情况，制作出产前感染引起的脑损伤^[11]， 同时利用部分宫内感染的小鼠于出生后连续腹腔 注射 LPS，使其新生儿期再次发生感染，出现“二 次打击”的情况，制作反复感染脑损伤动物模型。 本研究发现反复感染组小鼠体重不受影响，而脑 重量明显下降，焦油紫染色提示胼胝体变薄，侧 脑室扩大，说明反复感染比单纯宫内感染对脑损 伤的危害更为严重，而且对高级系统影响更明显。

到目前为止，宫内感染与新生期感染引起的 炎症反应、神经细胞凋亡仍是新生儿脑损伤不良 预后的重要机制，一直受到关注^[3]。在脑损伤的急 性期，LPS 可引起小胶质细胞、星形胶质细胞大量 激活，分泌TNF-α、I L-6、IL-8、NO 等各种炎症因子， 可以通过直接或间接作用引起神经细胞变性坏死。 LPS 也可与 TLR2 或 TLR4 结合，引起 NF-κb 释放 及下游 Caspase-3 激活，使神经细胞发生凋亡 ^[12]。 Yanowitz 等 ^[13]对胎龄 25~31 周的早产儿进行研究， 发现母亲有绒毛膜炎时，脐血 IL-6和IL-1β显著 升高。感染或细胞因子还可引起全身血流动力学 的不稳定，例如 TNF-α可直接使血管平滑肌舒张 血压下降。TNF-α和 IL-1β还能促使血管内皮细胞 生成舒血管因子，如前列腺环素和 NO，使血管舒 张。此外细胞因子还破坏血脑屏障，促使白细胞 迁移和黏附，使大量炎性反应细胞进入脑组织， 引起脑水肿，加重脑循环障碍。

少突胶质前体细胞是早产儿脑病的主要靶细 胞，无论产前还是新生儿期感染 / 炎症均可对少 突胶质细胞造成损伤。TNF-α是肿瘤坏死因素家 族重要成员之一，可直接杀死少突胶质细胞，机 制可能与其介导的死亡途径有关。TNF-α与肿瘤 坏死因子 I 型受体结合，激活 Caspase-3，从而引 起 Caspase 级联反应，诱导细胞凋亡^[14]。此外， TNF-α作为炎症因子也可抑制少突胶质细胞分化成 熟而影响髓鞘正常生成^[15]。在本研究，反复感染 后 MBP 染色评估脑白质发育情况，结果表明反复 感染组髓鞘化障碍更为明显，可能与感染 / 炎症损 伤少突胶质前体细胞 ,导致其凋亡有关。

本研究发现，围产期反复感染引起炎症因子 表达的更多，神经细胞凋亡也更严重，以后未成 熟脑髓鞘发育障碍更明显。机制可能是宫内感染 时，破坏血脑屏障功能，导致生后再次感染时各 种炎症因子更易通透血脑屏障，对少突胶质前体 细胞的损伤更大^[16,17]。其次，也有可能宫内感染时 抑制正常免疫系统，体内 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞 功能低下，出现对再次发生损伤的不耐受^[8]。再次， 早产儿脑血管自主调节功能障碍 ,容易形成压力被 动性脑血流，反复感染可能对脑室周围长短穿通 支血管影响更明显，导致脑供血不足，加重脑损 伤。最后，宫内感染时可能引起脑内炎症、凋亡、 兴奋性谷氨酸受体等相关基因高表达，影响未成 熟脑神经细胞的发育，当再次发生感染时进一步 促进这些基因表达，加重未成熟脑的损伤^[18]。

感染 / 炎症会导致神经行为的发育异常。评 价神经功能发育状况常见的指标在人类有新生儿 NBNA、贝利量表、Gesell 等，在啮齿类动物早期 评估包括步态反射、翻正反射、悬崖回避反射、 负向趋地反射等。神经行为的改变被认为是一种 早期评价脑损伤敏感的指标。这些早期行为反射 对了解远期发生神经功能障碍的几率很有意义^[19]。 本动物实验发现，反复感染组新生小鼠表现出明 显的神经发育障碍，表明围产期反复感染不仅对 神经细胞结构造成损伤，对其功能也产生不利影 响。早期的这些神经行为发育异常同样可预测远 期神经行为情况，同时提示及早采取合理干预措 施有非常重要的意义。

总之，本研究表明防治围产期感染是减少早 产儿脑病发生的关键，不仅要防治宫内感染，而 且要防治新生儿期感染，尽量避免围产期反复感 染对未成熟脑的多次打击，这将对降低早产儿脑 病发生率，提高远期生活质量有非常重要的意义。