2014, Vol. 16
肾母细胞瘤（Wilms' tumor,WT）是小儿最常 见的肾脏恶性肿瘤，占儿童恶性肿瘤的6%~7%， 大约75% 患儿发病年龄小于5 岁，平均发病年龄3.5 岁[1]。虽然通过手术、放疗及化疗的综合应用，患 儿预后已经有了极大的改观，但少数患儿由于复 发、转移及对化疗药物的不敏感导致死亡。肿瘤 的多药耐药是导致化疗失败的原因之一。因此如 何降低耐药性，提高化疗敏感性是目前亟待解决 的难题。苦参碱是一种传统中药成分，其抗肿瘤 作用越来越受到关注。研究发现苦参碱对儿童急 性淋巴细胞性白血病细胞、神经母细胞瘤LA-N-5 细胞、肝癌SMMC-7721 细胞、胃癌细胞、大肠癌 SW480 细胞、乳腺癌细胞等有抑制及杀伤作用， 且有明显的量效及时效关系[2, 3, 4, 5, 6]。程序性细胞死亡 4（programmed cell death 4,PDCD4）基因又称肿瘤 性转化抑制剂，是一种新的抑癌基因，可以促进 肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增生及侵袭， 并可增加肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。那么， 苦参碱对肿瘤的抑制作用是否与PDCD4 有关呢？ 目前这方面的报道不多。因此本研究通过观察不 同浓度苦参碱与固定浓度顺铂对人肾母细胞瘤SKNEP- 1 细胞生长的影响，研究苦参碱抗肿瘤作用及 其剂量依赖性，并探讨其可能的作用机制。
人肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞购自中国科学 院细胞库；Hyclone 改良型RPMI-1640 培养基及 Hyclone 胎牛血清均购自赛默飞世尔生物化学制品 北京有限公司；苦参碱（粉末，纯度≥ 98％，中 鑫科技生物有限公司）；顺铂（江苏豪森药业股 份有限公司）；流式试剂盒（Annexin-V-FITC 试剂盒， 北京宝赛公司）； 四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂 （Sigma 公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma 公 司）；TRIzol 液、TIANScript cDNA 第一链合成试 剂盒及2×Taq PCR Master Mix 均购自北京天根生 化科技有限公司；PDCD4 mRNA 的引物由上海捷 瑞生物工程有限公司设计及合成；β-actin 由艾博 思生物工程技术服务有限公司设计及合成。
人肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞置于含10％胎 牛血清和1％青霉素- 链霉素的RPMI-1640 培养液 中，于37℃、5％ CO2、100％湿度的培养箱中孵育。 每3、4 d 换液，7 d 左右传代1 次，维持细胞处于 对数生长期。
（1）对照组：人肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞 不经任何处理。（2）顺铂组：细胞加入5 μg/mL 顺铂作用16 h。（3）0.5 mg/mL 苦参碱组：细胞 加入0.5 mg/mL 苦参碱处理24 h。（4）1.0 mg/mL 苦参碱组：细胞加入1.0 mg/mL 苦参碱处理24 h。 （5）1.5 mg/mL 苦参碱组：细胞加入1.5 mg/mL 苦 参碱处理24 h。（6）0.5 mg/mL 苦参碱联合顺铂 组：细胞加入0.5 mg/mL 苦参碱处理24 h 后，加 入5 μg/mL 顺铂作用16 h。（7）1.0 mg/mL 苦参碱 联合顺铂组：细胞加入1.0 mg/mL 苦参碱处理24 h 后，加入5 μg/mL 顺铂作用16 h。（8）1.5 mg/mL 苦参碱联合顺铂组：细胞加入1.5 mg/mL 苦参碱处 理24 h 后，加入5 μg/mL 顺铂作用16 h。（9）空 白组：无细胞只有相应培养液。
收集对数生长期SK-NEP-1 细胞， 制成 1×104/mL 细胞悬液，接种于96 孔板，每组设6 个复孔，取其平均数。按上述分组加药处理后，每 孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，培养箱中孵育4 h， 吸去孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，震 荡15 min，于1 h 内在酶标仪测其波长492 nm 的 吸光度（OD 值）。 各组同时进行MTT 检测，空 白组调零，结果取均值。各组细胞的相对存活率= （[ 实验组吸光度- 空白组吸光度）（/ 对照组吸光度- 空白组吸光度）]×100％。实验独立重复3 次。
收集对数生长期SK-NEP-1 细胞， 制成 1×104/mL 细胞悬液，接种于六孔板，按上述分组 加药，每组3 个样本，实验独立重复3 次。各实 验组同时进行流式细胞检测，细胞用4℃预冷的 PBS 洗两遍并离心（1 000 rpm/min、10 min）后， 加Binding Buffer 200 μL 悬浮细胞， 加Annexin V-FITC 10 μL， 避光室温反应15 min 后， 再加 Binding Buffer 300 μL 及 PI 5 μL 混匀，于1 h 内在 流式细胞仪上检测。
收集对数生长期SK-NEP-1 细胞， 制成1×104/mL 细胞悬液接种在50 mL 细胞培养瓶 中，按上述分组加药，每组3 个样本，实验独 立重复3 次。各实验组同时进行RT-PCR 检测。 TRIzol 液提取细胞总RNA，具体操作按说明书 进行，紫外分光光度计（A260/A280）检测RNA 纯度及完整性， 按说明书步骤逆转录mRNA 为cDNA。PDCD4 引物： 上游序列（5' → 3'） AAAGGCGACTAAGGAAAAACTCATC； 下游序列 （5' → 3'） GCCTATCCAGCAACCTTCCCT， 片段 长度为129 bp。β-actin 引物：上游序列为（5' → 3'） CGAAACTACCTTCAACTCCATC ； 下游序列为 （5' → 3'） AGTGATCTCCTTCTGCATCCT， 片段 长度为130 bp。反应条件：94 ℃ 预变性 3 min； 94℃变性 30 s，58℃（PDCD4）/56℃（β-actin） 退火30 s，72℃延伸1 min，共30 个循环；最后 72℃延伸5 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。 利用电脑成像统计电泳后泳带密度，通过密度分 析测定目的基因产物与内参照基因产物的比率， 半定量分析目的基因的表达。
采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分 析。计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，多 组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较采 用SNK-q 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
各实验组SK-NEP-1 细胞的存活率均低于对 照组（均P<0.05），苦参碱组随药物浓度增加， 存活率逐渐降低。苦参碱联合顺铂组与相同浓 度单药苦参碱组比较，存活率均明显降低（均 P<0.05）。苦参碱联合顺铂组与顺铂组比较，存活 率均明显降低（均P<0.01）。见表1。
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表 1 各组细胞存活率及凋亡率 （x±s，％） |
各实验组SK-NEP-1 细胞的凋亡率均高于对 照组（均P<0.05），苦参碱组随药物浓度增加， 凋亡率逐渐增高。苦参碱联合顺铂组与相同浓 度单药苦参碱组比较，凋亡率均明显增高（均 P<0.01）。苦参碱联合顺铂组与顺铂组比较，凋亡 率均明显增高（均P<0.01）。见表1和<图1。
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图 1 流式细胞仪检测SK-NEP-1 细胞的凋亡 A：对照组；B：苦参碱0.5 mg/mL 组；C：苦参碱1.0 mg/mL 组； D：苦参碱1.5 mg/mL 组；E：顺铂组；F：苦参碱0.5 mg/mL+ 顺铂组；G：苦参碱1.0 mg/mL+ 顺铂组；H：苦参碱1.5 mg/mL+ 顺铂组。图中左上象限表示机械损伤的细胞；右上象限表示晚期凋亡以及继发坏死的细胞；左下象限表示存活细胞；右下象 限表示早期凋亡细胞。 |
各实验组PDCD4 mRNA 的表达水平均高于对 照组（均P<0.01）。苦参碱组随药物浓度增加， PDCD4 mRNA 表达水平逐渐增加（P<0.01）。苦 参碱联合顺铂组与相同浓度单药苦参碱组比较， PDCD4 mRNA 表达均显著提高（均P<0.01）。联 合顺铂组与顺铂组比较，PDCD4 mRNA 表达水平 均明显升高（均P<0.01）。见表2和<图2。
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表 2 各组细胞PDCD4 mRNA 表达 （n=3，x±s） |
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图 2 RT-PCR 检测SK-NEP-1 细胞中PDCD4 mRNA 表达 M：Marker；1： 对照组；2： 苦参碱0.5 mg/mL 组； 3：苦参碱1.0 mg/mL 组；4：苦参碱1.5 mg/mL 组；5：顺铂组； 6：苦参碱0.5 mg/mL+ 顺铂组；7：苦参碱1.0 mg/mL+ 顺铂组； 8：苦参碱1.5 mg/mL+ 顺铂组。 |
苦参碱化学名为苦参啶-15- 酮（Matddin-15- one），化学分子式为C15H24N20，是中药苦参的主 要活性成分之一，在体内外对多种肿瘤细胞有抑制 及杀伤作用，包括抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡， 可逆转多药耐药，且有明显的量效和时效关系[7]。 虽然化疗仍是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但传 统化疗药物毒副作用大，以及肿瘤的多药耐药，高 侵袭和转移的特征，是目前化疗成功的障碍。苦参 碱这种新型高效低毒抗肿瘤中药，对体外肿瘤细胞 除抑制及杀伤，诱导细胞分化与凋亡，抑制肿瘤转 移，调节肿瘤细胞宿主免疫等作用外[8]，还能逆转 多药耐药，提高传统化疗药物敏感性，使临床抗肿 瘤治疗取得更好的疗效[9]。 但苦参碱联合顺铂抗 SK-NEP-1 细胞作用鲜有报道。
细胞增殖和凋亡是细胞生物学行为的两个 重要方面，两者间动态平衡是维持机体稳态的一 个重要方式，苦参碱调节肿瘤细胞中某些基因表 达水平可能是其抗肿瘤机制之一。有研究报道， MYCN 基因，为MYC 原癌基因家族成员之一，具 有很强致癌潜能[10]，神经母细胞瘤LA-N-5 细胞高 表达MYCN 基因mRNA，苦参碱作用体外培养的 LA-N-5 细胞，抑制MYCN 基因mRNA，从而有效 抑制该细胞增殖，实现其抗肿瘤作用[4]。抑癌基因 也称为抗癌基因，在被激活情况下它们具有抑制 细胞增殖作用，但在一定情况下被抑制或丢失后 可减弱甚至消除抑癌作用的基因。肾母细胞瘤中 PDCD4 mRNA 及蛋白与癌旁正常对照组织相比明 显下调。肿瘤恶性程度越高，瘤组织中PDCD4 蛋 白表达下调越明显，PDCD4 mRNA 和蛋白可作为 评价肾母细胞瘤生物学行为的参考指标[11, 12]。
本研究显示，相对于对照组，苦参碱在一定 浓度范围（0.5~1.5 mg/mL）内能抑制SK-NEP-1 细 胞的增殖并诱导凋亡，具有剂量依赖性。因顺铂 毒副作用大，且易耐药。本研究通过不同浓度苦 参碱与固定浓度顺铂联合用药，发现随着苦参碱 浓度的增加，联合作用组抑制SK-NEP-1 细胞增殖 越明显。联合作用组存活率低于苦参碱、顺铂单 药组，而凋亡率增高。各实验组SK-NEP-1 细胞 的存活率均低于对照组，苦参碱组随药物浓度增 加，存活率逐渐降低，联合0.5 μg/mL 顺铂共同作 用SK-NEP-1 细胞后，与相同浓度单药苦参碱组及 顺铂组比较，存活率均明显降低。各实验组SKNEP- 1 细胞的凋亡率均高于对照组，苦参碱组随 药物浓度增加，凋亡率逐渐增高，联合0.5 μg/mL 顺铂共同作用SK-NEP-1 细胞后，与相同浓度单 药苦参碱组及顺铂组比较，凋亡率均明显增高。 说明苦参碱与顺铂有协同作用，能提高顺铂的化 疗敏感性。同时本研究发现随着苦参碱浓度的增 加，PDCD4 mRNA 的表达逐渐增高。与苦参碱、 顺铂单药组相比，联合作用组能明显提高PDCD4 mRNA 的表达，提示苦参碱联合顺铂可能通过提 高SK-NEP-1 细胞PDCD4 mRNA 的表达来发挥协 同作用，抑制细胞增殖诱导凋亡，提高苦参碱对 顺铂化疗敏感性，起到抗肿瘤作用。
综上，本研究证实苦参碱与顺铂联合应用， 通过上调PDCD4 mRNA 的表达，来抑制SK-NEP-1 细胞增殖，诱导凋亡。这可能为进一步研究苦参 碱通过其他途径与顺铂发挥协同抗肿瘤作用，奠 定了基础。
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