2014, Vol. 16
2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院 干细胞中心, 湖北 武汉 430022;
3. 三峡大学第一临床学院宜昌市中心人民医院儿科, 湖北 宜昌 443003
热带病毒整合位点（ecotropic viral integration site,EVI1）基因定位于染色体3q26，编码一个相 对分子质量14.5 万道尔顿的锌指转录因子，此转 录因子是一个位点特异的DNA 结合蛋白，定位于 核，参与RNA 的转录调节。 EVI1 基因主要控制 胚胎的发育，对造血干细胞的增殖和存活起重要 作用[1]。在白血病的发病中，EVI1 也是一个重要 的转录因子[2]。文献报道10% 的髓细胞性白血病 可检测到EVI1 基因高表达，并且是预后不良的独 立因子[3]。虽然目前有关EVI1 预后价值的文献报 道不少，但少有报道EVI1 阳性的急性髓细胞性白 血病（AML）患者的临床特征究竟如何。因此， 本文将对我院初诊的241 例AML 患儿EVI1 的表 达及其免疫表型进行检测，同时监测微小残留白 血病（minimal residual disease,MRD）， 并收集 EVI1 阳性患儿的临床资料以分析其临床特征。现 报道如下。
选取2009 年1 月至2013 年8 月于华中科技 大学同济医学院附属协和医院儿科血液病病区初 诊的AML 患儿241 例为研究对象，其中男114 例， 女127 例，中位年龄6.4 岁（0.4~13 岁），所有病 例均经骨髓细胞学和免疫分型检测，符合国际通 用FAB 诊断标准[4]，且均未接受过化疗。同时选 取10 例非恶性疾病（缺铁性贫血等）患者作为对 照组，其中男6 例，女4 例，中位年龄8.2 岁（0.8~ 10 岁）。随访时间截止至2013 年8 月30 日，中 位随访时间为36 个月（1~50 个月）。
收集所有AML 患儿的临床资料，包括初诊外 周血白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数。 所有患儿根据儿童急性髓细胞性白血病诊疗建议 武汉协作组AML09 方案给予治疗。诱导治疗为 DA 方案（柔红霉素+ 阿糖胞苷）或DAE 方案（柔 红霉素+ 阿糖胞苷+ 依托泊甙）。M3 型患儿除外。
治疗前取肝素抗凝的骨髓液2 mL，分离单 个核细胞，提取RNA。采用RT-PCR 法检测包括 EVI1 基因在内的29 种融合基因[5]。 对初诊已确定EVI1 表达阳性的患儿，在以后 骨穿同时采集骨髓液标本2 mL 用于实时荧光定量 聚合酶链反应法（RQ-PCR，ABL 作为内参）测定 EVI1 的表达量[6]。EVI1 的表达量=2-δδCt，其中 δδCt=δCt 患者-δCt 正常人，δCt 正常人=Ct 正常人EVI1- Ct 正常人ABL，δCt 患者=Ct 患者EVI1-Ct 患者ABL；当2-δδCt ≤ 8 时，该患者EVI1 为阴性；当8 ≤ 2-δδCt ≤ 32 时，该患者EVI1 为阳性低表达；当2-δδCt ≥ 32 时， 该患者EVI1 为阳性高表达。
采用流式细胞术分析骨髓细胞的免疫表型。 向流式专用管中加入EDTA 抗凝的骨髓及4 色直 接标记荧光抗体。所用单克隆抗体包括草履虫叶 绿素蛋白（Percp）标记的CD45 和异硫氰酸荧光 素（FITC）、藻红蛋白（PE）或别藻青蛋白（APC） 标记的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、 CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD19、 CD20、CD22、CD33、CD34、CD38、CD56、 CD64、CD71、CD117、CD123、MPO、cCD79a、 HLA-DR、cCD3 和胞膜或胞内同型对照IgG 等， 均购自美国BD 公司。采用FACS CaliburTM 流式 细胞仪（ 美国BD 公司）CellQuest 和PAINT-AGATE 软件获取并分析10 000 个细胞/ 管，通过 CD45/SSC 设门，分析计算各型白血病相关抗原的 阳性率。以幼稚细胞表面抗原≥ 20% 为阳性。采 用多参数流式细胞术（MFC）[7] 监测MRD，结果 判断以MRD<10-4 为阴性。
采集骨髓细胞标本，24 h 短期培养后制片， 收集有丝分裂中期细胞，热变性姬姆萨R 显带， 应用LeicaQ500 染色体自动分析仪，染色体核型分 析根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN） 1995》描述核型。
疗效标准参照文献[8]。治疗满2 周的患儿统 计缓解率，完全缓解（CR）定义为：临床无贫血、 出血等白血病细胞浸润的症状和体征；骨髓原始 幼稚细胞<5%，外周血未见幼稚细胞；外周血中 性粒细胞绝对值≥ 1.5×109/L，血红蛋白≥ 90 g/L， 血小板≥ 100×109/L。
采用SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，两 样本均数间的比较采用t 检验；计数资料以率（%） 表示，组间比较采用χ2 检验，当理论频数<1 时采 用Fisher 确切概率法。P<0.05 为差异有统计学意义。
241 例AML 患儿中，33 例（13.7%）EVI1 基 因表达阳性，包括男10 例（30%），女23 例（70%）； 其中 M2 型10 例，M4 型11 例，M5 型5 例，M6 型6 例，M7 型1 例； M0、M1、M3 型均无EVI1 基因阳性表达。10 例对照组均无EVI1 阳性表达。 AML 患儿各亚型的EVI1 基因阳性表达率差异有统 计学意义，见表1。
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表 1EVI1 基因在不同分型AML 患儿中的表达 |
33 例EVI1 表达阳性的AML 患儿初诊时肝肿 大25 例（76%），脾肿大20 例（61%），淋巴结 肿大20 例（61%），肝功能异常7 例（21%）， 凝血功能异常15 例（45%）。
EVI1 表达阳性与阴性的AML 患儿相比，初诊 年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白含量及血小板 计数差异均无统计学意义（均P>0.05），但EVI1 表达阳性组女性患儿比例增加（P<0.05），见表2。
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表 2EVI1 表达阳性AML 患儿的临床特征 （x±s，例） |
截止随访日期，33 例初诊EVI1 基因表达阳 性患儿中， 15 例转阴（45%），转阴时间为1.5~ 19 个月。2 例确诊后放弃，31 例患儿进行了诱导 缓解治疗，诱导缓解治疗结束后31 例患儿EVI1 基因的中位表达值为12.05（ 范围0~24.05）。 EVI1 表达改变与临床缓解不同步，部分患儿EVI1 转阴时间滞后于临床缓解，如：3 名患者第1 疗程 诱导后达CR，但EVI1 仍表达阳性，后期随访时 复查EVI1 转阴；1 名患者第2 疗程诱导后达CR， 但EVI1 始终阳性；1 名患者第2 疗程诱导后达 CR，但4 个月后EVI1 才转阴。还有部分患儿临床 未缓解，但EVI1 已转阴，如：1 名患者第1 疗程 诱导后即达CR，但4 个月后复发时检测EVI1 表 达呈阴性；2 名患者在第1、2 疗程诱导后均未达 CR，但在第1 疗程结束时，EVI1 表达已呈阴性。
33 例EVI1 表达阳性的AML 患儿中，12 例患 儿用MFC 法监测MRD。5 例患儿MRD 与EVI1 基 因表达同步转阴；2 例患儿MRD 转阴后，EVI1 基 因表达仍呈阳性，分别于1 个月和9 个月后EVI1 才转阴；5 例患儿监测MRD 呈阳性，其中4 例 EVI1 基因表达呈阳性，1 例EVI1 基因检测已转阴。
EVI1 常与其他融合基因共表达。33 例EVI1 表达阳性的AML 患儿中，有13 例（39%）共表 达其它融合基因。如dupMLL、AML1-ETO、MLLAF9 、AML1、MDS1、MLL/AF10。
33 例EVI1 表达阳性的AML 患儿高表达 CD33（100%）、CD38（88%）、HLADR（76%）， 其次CD13（73%）、CD117（73%）、CD123（67%）、 CD64（64%）、MPO（61%）、CD11b（58%）、 CD15（55%）也有不同程度地表达。
33 例EVI1 表达阳性的AML 患儿中，30 例患 儿进行了染色体检查。15 例染色体核型分析正常 （50%）；15 例患者发现染色体结构或数目异常 （50%），其中3 例患者有3q 位点异常，2 例患 者存在7 号染色单体，5 例患者存在11 号染色体 重排，见表3。
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表 3EVI1 阳性AML 患儿的异常染色体 |
33 例EVI1 表达阳性的AML 患儿中，2 例确 诊后放弃治疗，31 例患儿进行了诱导缓解治疗， 1 个疗程后， 7 例达CR，2 例死亡，CR 率为23% （7/31）；随后29 例完成第1 疗程诱导治疗的患 儿中，又有3 例放弃治疗，26 例进入第2 疗程化 疗，疗程结束后新增6 例达CR，2 例死亡，CR 率 为23%（6/26）。208 例EVI1 表达阴性的AML 患 儿中，23 例确诊后放弃治疗，1 个疗程后，118 例达CR，CR 率为64%（118/185）， 明显高于 EVI1 表达阳性患儿第1 疗程CR 率（χ2=19.035，P<0.001）；随后185 例完成第1 疗程诱导治疗 的患儿中，又有15 例放弃治疗，170 例进入第2 疗程化疗，疗程结束后新增26 例达CR，CR 率 为15%（26/170）， 与EVI1 表达阳性患儿第2 疗程CR 率比较差异无统计学意义（χ2=0.399， P=0.528）。2 个疗程EVI1 阳性患者的总CR 率 42%（13/31），明显低于EVI1 阴性患者的总CR 率（78%，144/185） （χ2=17.238，P<0.01）。
尽管EVI1 基因早在1988 年就已经被发现[9]， 然而目前人们对其本质了解并不多。EVI1 基因一 直作为一个髓系肿瘤的癌基因被研究，但阳性表 达的患者临床特征如何？其在髓系肿瘤发生中究 竟起什么作用？虽然有关EVI1 的报道很多，却并 没有解决这些问题。本研究拟通过对EVI1 阳性 AML 患儿的临床分析，对此进行初步探讨。
本资料中AML 患儿阳性表达率为13.7%，与 文献报道基本一致[3]。M2、M4、M5、M6、M7 亚 型均有EVI1 阳性表达，M0、M1、M3 型患儿未见 EVI1 基因阳性表达，而 Lugthart 等[3] 报道成人所 有AML 亚型均可见EVI1 阳性表达。Ho 等[10] 临床 试验发现几乎所有M7 患儿都有EVI1 高表达。是 否儿童患者有不同的表达谱，或者因为样本数较 少，还需进一步扩大样本数来明确。
EVI1 阳性与阴性的AML 患儿相比，初诊时 年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白含量、血小 板计数等临床特征并无明显差异，但女性患儿比 例增加，其原因尚不明确。
在大多数情况下，白血病细胞学检测往往落 后于基因检测，即基因检测阳性时，细胞学检测 可能还是阴性。本研究结果提示： EVI1 表达改变 与临床缓解不同步。部分患儿EVI1 转阴滞后于临 床缓解，而部分患儿临床未缓解，EVI1 已转阴。 其原因尚未见文献报道。是否EVI1 的表达与AML 的进展不同步？考虑临床观察的结果，认为EVI1 基因检测暂不宜作为MRD 的指标。MFC 法监测 MRD 阴性时，EVI1 基因表达检测仍可呈阳性。 MFC 法监测MRD 阳性时，EVI1 基因也可转阴。 因为MFC 监测MRD 分析的是细胞表面或胞浆抗 原，MFC 监测MRD 阴性而PCR 法却检测EVI1 基 因表达阳性，提示部分EVI1 阳性的AML 细胞表 面或胞浆没有可检测到的抗原变化。Konantz 等[11] 研究发现在体外培养淋巴细胞性白血病细胞，阻 抑其EVI1 的表达并不能改变细胞表面抗原的表达。 因此，临床监测MRD 需结合流式细胞术和PCR 基因分析法。
EVI1 常与其它融合基因共表达，本研究结 果提示有39% 的患儿共表达其它融合基因。如 dupMLL、AML1-ETO、MLL-AF9、AML1、MDS1、 MLL/AF10。研究报道MLL 通过染色体重排或其它 不明机制可导致EVI1 转录活化，导致人类AML 发生。大约一半有11q23 重排的AML 患者有EVI1 高表达[12]。另外文献报道还有一些与EVI1 基因相 互作用的基因[13, 14, 15, 16]，但其相互作用的机制仍不明确。
染色体分析发现15 例AML 患儿染色体核型 分析正常（50%），15 例有染色体结构或数目异 常（50%）。目前 3q26 重排是研究明确的可导致 EVI1 过表达的机制，如t（3；3）（q21；q26）， inv（3）， t（3；21）等[17, 18]。Ho 等[10] 的临床试 验报道儿童AML 没有检测到3q26 的重排。而其 它文献报道儿童AML 可检测到3q26 的重排[19] 。 本研究中3 例患儿有3q26 位点异常，3q 异常占染 色体异常的20%（3/15）。然而据报道9%~20% 没有3q 异常的AML 也有EVI1 过表达，并且与不 良预后相关[20]。7 号染色单体是导致EVI1 活化的 另一个因素[12]。本研究中2 例患者存在 7 号染色 单体13%（2/15）。另外正常核型也可有EVI1 高 表达，本研究中15 例染色体核型分析正常（50%）。 Vazquez 等[21] 研究发现EVI1 高表达的发生率在不 同的细胞遗传学组明显不同，且在高危AML 进展 中，有不同剪接形式的EVI1 高表达。因本研究样 本例数不多，没有进一步分组，但可以发现EVI1 阳性的AML 有各种形式的核型改变，也有正常核 型。是否核型与EVI1 阳性表达有相关性，还需大 样本的研究进一步明确。
EVI1 的预后价值也是一个有争论的问题。 Langabeer 等[22] 报道在AML 患者中，EVI1 表达异 常很常见，与预后无关。多数文献报道EVI1 异 常表达与不良预后相关[23, 24]，EVI1 异常表达是预 后不良的独立因素[3]，本研究证实EVI1 表达阳性 AML 患儿第1 疗程CR 率明显降低，近期预后差。 而目前尽管有很多文献报道EVI1 异常表达与不良 预后相关，但人们还不清楚其生物学本质，不像 一些已经明确的与预后相关的基因如BCR/ABL、 FLT3 有明确的致白血病机制，因此也还没有文献 报道将EVI1 基因作为一个危险分层的因子[25]。本 课题组还在进一步随访以评估远期预后，而对于 EVI1 阳性的患儿暂不考虑应用更强的化疗方案。
另外，为什么临床观察到EVI1 基因阳性的 AML 患儿近期预后差，而其基因表达改变却与临 床缓解并不同步呢？我们认为EVI1 基因具有广泛 的生物学作用，通过多种机制参与白血病的发生 发展，并调节信号通路，作用于下游的靶基因而 发挥致白血病作用。其中可能存在许多当前未知 基因的改变[26]。而且本研究中也观察到 EVI1 基因 和一些融合基因共表达，由此可见EVI1 基因的活 化在AML 的病程中不是孤立的，而是与其它基因 相互作用或染色体异常的结果，其活化机制及功 能还需进一步研究。文献报道在鼠模型上，EVI1 过表达可诱导骨髓异常增生综合征发生，但不进 展为AML，提示在进展为AML 中还需要其它基因 的协同作用[21]。鼠模型逆转录病毒插入突变提示 EVI1 在髓系白血病的发生中与其它基因有协同作 用[27]。因此，寻找与EVI1 基因相互作用的上游或 下游基因将是今后进一步研究的方向。
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