中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (2): 170-173   PDF    
引用本文
王薇, 邱正庆, 宋红梅. 1例遗传性多发性骨软骨瘤家系EXT1基因分析[J]. 动物营养学报, 2014, 16(2): 174-180.  
WANG Wei, QIU Zheng-Qing, SONG Hong-Mei. A splicing mutation of EXT1 in a Chinese pedigree with hereditary multiple exostoses[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014, 16(2): 174-180.  
1例遗传性多发性骨软骨瘤家系EXT1基因分析
王薇, 邱正庆, 宋红梅     
中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院儿科, 北京 100005
收稿日期：2013-9-3，修改日期：2013-12-9
作者简介：王薇，女，硕士研究生，研究实习员。
通讯作者：宋红梅，女，教授。
摘要：目的 遗传性多发性骨软骨瘤（HME）是一种常染色体单基因显性遗传骨发育异常疾病，超过70% 为EXT1、EXT2 突变所致。该文目的是分析一HME 家系（3 代24 名成员，6 名HME 患者）临床特征及致病基因与突变；并通过文献复习统计分析中国人种基因突变情况。方法 收集、整理、分析该家系临床资料；应用PCR 及直接测序进行EXT1 基因分析；应用Pubmed 及万方数据库检索中国人种HME 基因突变文献。结果 （1）该家系起病年龄逐代变早，骨软骨瘤发作部位及数量逐代增多，身体变形逐代严重。（2）患者均发现EXT1 基因杂合剪切突变IVS5+1G>A，该突变在中国人中首次发现。（3）至今中国HME 家庭（含该家系）基因突变构成比为EXT1 为29%（26/90），EXT2 为43%（39/90）。结论 （1）该HME 家系呈现病情逐代加重情况。（2）该家系由EXT1 基因剪切突变IVS5+1G>A 导致发病。（3）中国人种EXT1、EXT2 突变构成比与西方人不一致。
关键词： 遗传性多发性骨软骨瘤     EXT1剪切突变     中国EXT 突变谱     儿童    
A splicing mutation of EXT1 in a Chinese pedigree with hereditary multiple exostoses
WANG Wei, QIU Zheng-Qing, SONG Hong-Mei     
Department of Peadiatrics, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005
Abstract: Objective Hereditary multiple exostoses (HME) is an autosomal dominant monogenic disorder of paraplasia ossium. Mutations in EXT1 and EXT2 have been suggested to be responsible for over 70% of HME cases. This study aimed to analyze the clinical features and pathogenic mutations in a Chinese family with HME (6 patients in 24 members of 3 generations) and to review the relative literature regarding mutations in EXT1 and EXT2 in the Chinese population. Methods Clinical pedigree dada from a Chinese family of HME were collected and analysed. EXT gene mutations in this pedigree assessed by PCR and sequencing. Pubmed and Wanfang (a Chinese database) were searched for the literature related to gene mutations in Chinese HME patients. Results In the pedigree analyzed, the age of onset of HME was becoming younger, the disease was becoming more severe, and the number of osteochondromas was increasing, in successive generations. A splicing mutation IVS5+1G>A, first identified in Chinese population, was found in all diseased members of this pedigree. According the currently available literature, EXT1 and EXT2 mutations have been detected in 29% (26/90) and 43% (39/90) Chinese families with HME. Conclusions HME starts earlier and becomes more severe and extensive with each successive generation in members of the pedigree analyzed. A splicing mutation, IVS5+1G>A, of EXT1, first identified in Chinese population, may be responsible for HME in the studied pedigree. EXT1 and EXT2 mutation rates may be different between the Chinese and Western populations.
Key words: Hereditary multiple exostoses     Splicing mutation of EXT1     Chinese EXT mutation spectrum     Child    

遗传性多发性骨软骨瘤（hereditary multiple exostoses,HME）是一种先天性骨发育异常疾病， 要累及软骨化骨的骨骼，以长骨干骺端多发性 外生骨疣为特征[1]。该病为常染色体单基因显性 遗传病，与EXT 抑癌基因突变有关，现已发现与 HME 有关的有EXT1、EXT2，其中>70% 的HME可检测到EXT1 或EXT2 突变[1]。EXT1 基因位于 染色体8q24.11~q24.13，其cDNA 由3.4 kb 碱基组 成，编码11 个外显子，746 个氨基酸。EXT2 位 于染色体11p12-p11，编码16 个外显子[1]。据人 类基因突变数据库（www.hgmd.cf.ac.uk）检索，至 2013 年1 月共报道EXT1 基因突变420 种，有错 义/ 无义突变（140 种）、剪切突变（44 种）、调 控区突变（1 种）、微小缺失（146 种）、微小插 入（49 种）、微小缺失插入（8 种）、交叉缺失（26 种）、复杂重排（6 种）等突变，未见大片段重复； EXT2 突变197 种，包括错义/ 无义突变（65 种）、 剪切突变（24 种）、调控区突变（6 种）、微小 缺失（55 种）、微插入（25 种）、微小缺失插入（5 种）、交叉缺失（17 种），未见复杂重排及大片 段重复。另根据多发性骨软骨瘤突变数据库（MOdb, Multiple Osteochondromas Mutation Database,http:// medgen.ua.ac.be/LOVD）所收集数据，少数患者存 在EXT1 或EXT2 的整个/ 部分基因缺失，为拷贝 数变异。至2013 年6 月14 日，共收录EXT1 变异 429 种，EXT2 突变223 种。该数据库不仅收录已 报道突变，同时收录未正式发表的数据，所以突 变种类及数量多于人类基因突变数据库所收录。 本研究通过对1 例HME 家系3 代进行EXT1 基因 分析及临床资料整理，以明确该家系临床特点及 致病基因突变；并回顾中国人种EXT 基因报道文 献，统计分析中国人种EXT 基因突变情况。

1　资料与方法
1.1　研究对象

2010 年7 月份2 名患儿（E、F）以“多发关 节部位肿物”于我院就诊，进而收集汉族HME 一 家系（家系图见图 1），共3 代24 人，其中患者 6 人（A、B、C、D、E、F），3 男3 女，随访至 2013 年2 月。所有患者均表现为关节周围大小不 等的多发肿物，质硬，无压痛，界限清楚，移动性差， 表面皮肤正常；可同时伴有骨骼畸形及活动障碍， 无关节肿痛；部分患者伴有矮小（见表1，临床表 现严重程度评分标准参考文献[2]，具体标准如下： 发病年龄<3 岁，1 分；身高< 第25 百分位，1 分； 肿瘤累及7 个关节以上或6 个关节+ 累及其他扁骨， 1 分；单个骨个肿瘤数量>5，1 分；肢体有外观畸 形及功能障碍，1 分。≥ 3 分为重度，3 分以下为 轻度）。患者家属均签署知情同意书。

图 1 　HME 家系图　　 A、B、C、D、E、F、为患者，其中E、F 为先证者。

表 1HME 家系基本临床资料
1.2　研究方法

取外周抗凝血2 mL，应用威格拉斯DNA 提取 试剂盒提取DNA。经Primer 3.0 对EXT1 全部11 个外显子及外显子内含子交界处在线设计引物（引 物序列及PCR 产物长度见表2），由英潍捷基（上 海）贸易有限公司合成。对EXT1 全部11 个外显 子及外显子内含子交界处进行PCR 扩增，PCR 体 系：博迈德? 2×PCR mix 12 μL，dd H2O 11 μL， DNA 1 μL，10 μmol/L 引物1 μL。PCR 条件：95℃ 5 min；每个循环94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s （E1 1 min），共35 个循环；72℃延伸10 min；4℃ 维持。PCR 产物经2% 凝胶电泳分离，纯化，测序。

表 2EXT1 PCR 扩增引物序列
1.3　中国人种EXT 基因突变谱统计

经Pubmed 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/）及万方数据知识服务平台检索近20 年中国人种HME 基因突变报道的相关文献，剔除 重复报道病例，总结中国人种EXT1、EXT2 突变 情况。

2　结果
2.1　临床资料分析结果

该家系所有成员均非近亲婚配，6 名患者骨 疣数量从2~20 余个不等，大小不等，每名患者的 最大骨疣皮面突出从约1 cm 到5 cm 不等（按照患 者最大骨疣的体积排序：F>E>B>C>D>A），骨软 骨瘤分布情况见表3。第三代发病年龄均在1~2 岁 之间，第二代在10 岁之后，第一代A 女士病情较 轻，无骨骼畸形，无活动受限，60 岁之前未察觉 骨疣存在，于D 发病后仔细寻找，发现两处，隐 隐突出皮面，未进行任何处理，于2012 年因贲门 癌去世。其余患者均存在不同程度的骨骼畸形（图 2 ），且进行了骨软骨瘤切除术。除患儿E 外，其 余患儿术前X 片在我院就诊前均遗失。患者E 的 X 线检查（图3）提示：左桡骨远端、尺骨远端密 度不均肿物，皮质完整；右膝稍外翻，双胫骨远 近端、股骨远端、腓骨头多个类圆形及指状肿物； 受累骨端膨大增粗；未见皮质破坏、日光放射影。 病理诊断为：骨软骨瘤。该家系第一代及第二代 均为轻度，第三代均为重度。

表 3骨软骨瘤部位分布

图 2骨骼畸形　　 A、B：患儿F 右足第三趾短趾畸 形及拇趾外翻（箭头所示）；C: 患儿E 左肘内翻；D：患儿E 站 立位双下肢全长X 线检查提示双下肢不等长。

图 3 患儿E 多发骨软骨瘤X 片　　 A、B：左尺、桡 骨远端可见多个骨疣（箭头所示），受累骨端变粗大；C、D：双 膝关节正位及侧位X 线提示双侧股骨远端、胫、腓骨近端多发骨 疣（箭头所示）。
2.2　家系基因分析结果

HME 患者均检测到EXT1 基因杂合剪切突变 IVS5+1G>A（c.1417+1G>A），经人类基因数据库 检索，该突变曾在一英裔家系报道中被报道[3]，为 已知致病突变。家系中其他成员未检测到该突变。

图 4EXT1 基因杂合剪切突变[IVS5+1G>A（c.1417+1G>A）]
2.3　中国人EXT 突变检索结果

共检索到涉及中国人种EXT 基因检测的文献 25 篇[2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]，含中文文献13 篇，英文文献12 篇， 涉及15 家机构。剔除重复报道病例后，加上本文 所报道的家系，共报道了中国人26 种（26 个家庭） EXT1 突变：每个家庭各发现了1 种突变，突变类 型最多的是移码突变13 种（11 种缺失突变）、错 义突变5 种、无义突变4 种，剪切突变3 种。30 种（39 个家庭）EXT2 突变：突变类型最多的是 无义突变11 种（16 个家庭），错义突变8 种（10 个家庭），移码突变8 种（8 个家庭），剪切突 变3 种（5 个家庭）。EXT2 最常见突变有4 种， 每种都分别在3 个家庭中发现，为：c.1016G>A， p.Cys339Tyr[2, 12]；c.313A>T，p.Lys105X[7, 17, 23]； c. 1234C>T，p.Gln412X[23]；IVS2+1 G>A[16, 20]。25 个 家庭未发现EXT1 或EXT2 突变。

至今中国HME 家庭（含该家系）基因突变 EXT1 为29%（26/90），EXT2 为43%（39/90）， 28%（25/90）未检测到EXT1 或EXT2 突变。

3　讨论

据国外文献报道，HME 在总人群的发病率约 为1 : 50 000[28]，男女比约为1.5 : 1[29, 30]，可能是由于 女性具有较轻的表型而被忽略。有统计1984~2006 年国内已发表文献共报道75 个家系573 例HME 患者，男女患者比为1.89 : 1[31]。国外报道约62% 的HME 具有家族遗传史，3 岁前发病者达50%， 12 岁前为96%~100%[29]。在本研究家系中，HME 患者男女比例为1 : 1，前两代均为女性，在临床分 型中属于轻型，发病年龄晚（均在11 岁之后）， 且累及关节部位少，骨软骨瘤数量较少。第三代 均为男性，发病年龄早，均为1~2 岁间发病，累 及关节部位多，单个关节所长骨疣数量多，总量多， 身体畸形严重。本家系符合女性发病较轻的报道， 但12 岁后发病率为33%（2/6），与报道[29] 不同。 这可能是由于发病晚患者均为女性，病情较轻， 早期医疗手段欠缺，未及时发现。一般HME 恶变 率为0.5%~5%[32]，多数为软骨肉瘤，本家系中未 出现恶变病例。该病73% 经父亲遗传[31]，而本家 系为经母遗传，且第一代患者子女发病率为33% （2/6），第二代患者生子发病率为100%（3/3）。 HME 患者的骨软骨瘤在10 岁前随年龄增长

而增长，在青春期生长板闭合后停止生长[33]。本 家系中患者B 11 岁时仅于股骨远端生长1 个骨疣， 手术切除后未复发。15 岁时环绕双膝渐发大小不 等3 个骨疣（与原位置不同），尺桡骨远端1 个骨疣， 初不影响生活，于49 岁时因严重影响行走进行了 膝盖部位第二次手术。患者F 19 岁，骨疣仍在继 续增长，而且出现了术后原位复发情况，这与国 外报道[33] 不同。

身材矮小是HME 的本质特征[31]，但很少引 起侏儒症。李玉婵等[2] 通过对11 个EXT1 突变及 6 个EXT2 突变患者的比较，发现8 例EXT1 突变 患儿（73%）身高< 第25 百分位，认为EXT2 身 高相对较高。本家系中仅2 例（33%）身高低于 第10 百分位，其余身高基本正常。因此EXT1 突 变是否导致身材矮小有待于更大样本量的研究。 HME 多位于软骨化骨，尤其是四肢的长骨，环膝 盖最多，不影响颅面骨骼[32]。1/3~2/3 为肢体畸形， 主要为前臂变短弯曲、腕部尺偏畸形及踝部外翻 畸形[31]。关于发生畸形的原因尚不清楚[31]。本家 系中环膝关节骨疣最多，5 名都出现了身体畸形， 涉及部位广泛，畸形种类多样，主要为膝外翻， 肩胛骨膨隆及双下肢不等长。

本研究报道的家系中，前两代均为轻型，第 三代均为重型，临床表现随遗传代次增加而加重。 回顾所报道的中国人种HME 家系文献，家系报道 虽多，但具有详细家系代次临床表现差异分析的 文献较少。唐英杰等[34] 所报道一个HME 家系， 4 代之间临床表现无显著差异，Xiao 等[4] 报道了 一个6 代35 例HME 家系，32 例均表现为重型，3 例（第V 代2 例，第VI 代1 例）表现为轻型。9 篇文献[5, 6, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40] 共报道了9 个家系（遗传代次2~6 代） 均出现了随遗传代次增加而病情加重现象。综合 文献报道，中国HME 家系呈现临床表现随遗传代 次增加而加重的趋势。该现象是否是该病的一个 特点，或者是否与基因型有关，需要更多的资料 以证实。同家系中虽然突变类型一致，然而临床 表现不同，为何逐代加重，需要进一步研究。 HME 为常染色体单基因显性遗传病，外显 率为100%[31]。该病与EXT 抑癌基因突变有关， 现已发现与HME 有关的EXT1、EXT2，另外染色 体19p 与该疾病的关联提示EXT3 存在。EXT1、 EXT2 已被克隆，但EXT3 尚未被确定，其中 >70% 的HME 可检测到EXT1 或EXT2 突变[1]。 国外文献中EXT1 基因突变约占44%~66%[41, 42] 的 HME 家庭，EXT2 约占27%[42]。由此可见，EXT1 与EXT2 突变比率与国外报道不符。回顾25 篇报 道中国人种HME 基因突变文献[2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]，并结合本 家系的基因突变，可见EXT1 基因突变异质性较 EXT2 高，迄今未见两个中国家庭具有同种EXT1 突变的报道。EXT2 的常见突变有4 种：c.1016G>A， p.Cys339Tyr[2, 12]；c.313A>T，p.Lys105X[7, 17, 23]； c. 1234C>T，p.Gln412X[23]；IVS2+1 G>A[16, 20]，提示 这些突变可能为中国人种的常见突变。缺失突变是 中国人种EXT1 最常见突变，与之不同的是EXT2 最常见的突变为无义突变。本家系中所检测到的 EXT1 剪切突变c.1417+1G>A（IVS5+1 G>A），在 中国人中首次报道。中国人种EXT1 基因报道过的 剪切突变有两种IVS8+2 T>G[2, 21] 及c.1883+1G>A[27]。 EXT1 及EXT2 编码的蛋白质对于细胞表面及 细胞外基质的蛋白聚糖表达起作用[43, 44]。EXT1 启 动子结构为一典型的“看家”基因，而且在许多 组织内有表达，其编码产物为一内质网固有的II 型 跨膜糖蛋白[45]，它修饰和增加乙酰肝素氨基葡 聚糖（GAGs）从分泌性细胞器向细胞表面分泌， 而该物质在细胞表面是一种细胞信号的重要辅助 部分[31]。Hecht 等[33] 注意到尽管EXT1 蛋白在多 种器官中表达，但EXT1 失活或突变体仅在生长骨 中有影响，伴随着骨生长，骨软骨瘤向骨干迁移。 在青春期生长板闭合后，生长发育停止，且无新 的骨软骨瘤形成。HME 中EXT1 突变后导致细胞 生长、分化、黏附功能异常，致使骨干或骺端软 骨细胞无限增殖，导致骨赘形成。EXT2 与EXT1 有30.9% 的同源性，McCormick 等[46] 研究提示 EXT2 在EXT1 失活时不具备显著的糖基转移酶活 性。值得注意的是高尔基体定位的EXT1/EXT2 复 合体氨基转移酶活性显著地高于EXT1 或EXT2 单 独存在时。这解释了两者任一基因失活都会导致 HME 的现象。

本研究家系中的突变位点处于剪接给位GT 保 守位点，该位点突变可能引起以下一种或几种premRNA 加工的异常：外显子跳跃、隐匿剪切位点 应用或内含子保留。任一情况下，mRNA 都会出 现提前终止密码子，最终导致合成无功能的截短 蛋白。本课题组今后将继续研究该家系的mRNA 情况，以明确是何种类型。

综上所述，（1）本研究报道的家系临床资 料提示：该家系为经母遗传，男性临床表现重于 女性；发病年龄晚的临床表现较轻；青春期后骨 疣数量及大小仍可增长，手术后可原位复发；临 床表现逐代加重，骨疣大小增加、数量增多、发 病部位增多（可对称，可不对称分布）、骨骼畸 形逐代严重、畸形部位增多，子女发病率增高。 （2）综合文献报道，中国HME 家系呈现临床表 现随遗传代次增加而加重的趋势。该现象是否是 该病的一个特点，或者是否与基因型有关，需要 更多的资料以证实。同家系中虽然突变类型一致， 但临床表现不同，为何逐代加重，需进一步研究。 （3） 中国HME 家庭基因突变EXT1 为29%， EXT2 为43%，28% 未检测到EXT1 或EXT2 突变， EXT1 及EXT2 突变与国外报道可能呈倒置现象。 中国人种EXT1 最常见突变是缺失突变，EXT2 最 常见的突变为无义突变，EXT2 突变热点有4 种。 本家系中所检测到的EXT1 剪切突变c.1417+1G>A （IVS5+1 G>A），在中国人中首次报道。

HME 虽对患者寿命可能不造成严重影响，但 在重度情况下可造成患者的行动、生活不便，从 儿童时期开始伴随一生的身体畸形、矮小造成患者及其家庭巨大的心理压力。由于该病为常染色 体显性遗传，该家系患者对于适婚青年患者的婚 配、生子充满恐惧及自卑心理，恋爱受挫严重影 响患者的心理健康。该家系致病基因的发现进一 步补充了中国HME 的基因突变资料，更重要的是 对于该家系下一代的产前诊断将有可能提供帮助， 为其家庭带来新的希望。

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