中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (2): 198-202   PDF    
引用本文
邹丽萍, 张希, 张艳等.STAT6和ORMDL3在哮喘小鼠肺组织中的表达及布地奈德的干预作用[J]. 中国当代儿科杂志, 2014, 16(2): 198-202.  
ZOU Li-Ping, ZHANG Xi, ZHANG Yan et al. Down-regulatory effects of budesonide on expression of STAT6 and ORMDL3 in lung tissues of asthmatic mice[J]. CJCP, 2014, 16(2): 198-202.   
STAT6和ORMDL3在哮喘小鼠肺组织中的表达及布地奈德的干预作用
邹丽萍,,张希,张艳,许秀娟,王铁锋    
郑州大学第三附属医院儿内科, 河南 郑州 450052
收稿日期：2013-7-13，修改日期：2013-12-27
基金项目：郑州市科技局的计划项目（121PPTGG507-21）。
作者简介：邹丽萍，女，本科，主任医师。
摘要：目的 探讨信号转导和转录激活因子6（STAT6）以及哮喘易感基因血清类黏蛋白1 样蛋白3（ORMDL3）在哮喘小鼠气道重塑中的作用，并观察布地奈德（BUD）对上述两种物质水平的干预作用。方法 BALB/c 雌性小鼠30 只，随机分为对照组、哮喘组和BUD 组。应用鸡卵清蛋白（OVA）激发试验建立哮喘小鼠模型，BUD 组在每次激发前30 min 应用生理盐水溶解的BUD 雾化液进行雾化吸入，对照组应用生理盐水替代OVA 溶液。苏木精-伊红染色及Masson 染色观察各组小鼠气道病理学改变；ELISA 法检测各组小鼠肺组织匀浆中IL-13 水平；RT-PCR 法检测各组肺组织STAT6 及ORMDL3 的mRNA 表达。结果 哮喘组气道病理学改变较正常组和BUD 组明显，而BUD 组气道病理学变化较哮喘组减轻。哮喘组和BUD 组IL-13 水平、STAT6 及ORMDL3 的mRNA 表达均明显高于对照组（P<0.05），且哮喘组IL-13 水平、STAT6 和ORMDL3 的mRNA 表达均高于BUD 组（P<0.05）。Pearson 相关分析显示STAT6 和ORMDL3 mRNA 在哮喘组的表达呈正相关（r=0.676，P=0.032）。结论 STAT6 和ORMDL3 可能参与了小鼠气道重塑过程，BUD 可能通过下调STAT6和ORMDL3 的mRNA 表达，改善气道重塑。
关键词： 哮喘     STAT6     ORMDL3     气道重塑     小鼠    
Down-regulatory effects of budesonide on expression of STAT6 and ORMDL3 in lung tissues of asthmatic mice
ZOU Li-Ping ,ZHANG Xi, ZHANG Yan, XU Xiu-Juan, WANG Tie-Feng    
Department of Pediatrics, Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China
Abstract: Objective To investigate the roles of signal transduction and activator of transcription 6 (STAT6) and orosomucoid 1-like 3 (ORMDL3) in airway remodeling among asthmatic mice and to observe the effects of budesonide (BUD) on their expression. Methods Thirty BALB/c mice were randomly divided into control, asthma, and BUD intervention group. The mice were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) to establish a mouse model of asthma. The BUD intervention group received aerosol inhalation of BUD dissolved in normal saline 30 minutes before each OVA challenge, while normal saline was used instead of OVA solution in the control group. The pathological changes in the airway were observed by hematoxylin-eosin staining and Masson staining. The interleukin-13 (IL-13) level in lung homogenate was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The mRNA expression of STAT6 and ORMDL3 was measured by RT-PCR. Results The asthma group showed more pathological changes in the airway than the control and BUD intervention groups, and the BUD intervention group had reduced pathological changes in the airway compared with the asthma group. The asthma and BUD intervention groups had significantly higher IL-13 levels and mRNA expression of STAT6 and ORMDL3 than the control group (P<0.05), and these indices were significantly higher in the asthma group than in the BUD intervention group (P<0.05). The Pearson correlation analysis showed that STAT6 mRNA expression was positively correlated with ORMDL3 mRNA expression (r=0.676, P=0.032). Conclusions STAT6 and ORMDL3 may be involved in the airway remodeling of mice, and BUD can reduce airway remodeling in asthmatic mice, possibly by down-regulating mRNA expression of STAT6 and ORMDL3.
Key words: Asthma     STAT6     ORMDL3     Airway remodeling     Mice    

支气管哮喘（bronchial asthma），简称哮喘， 是儿童时期最常见的慢性呼吸道疾病，反复喘息 严重威胁儿童的身心健康，因此研究哮喘的发病 机制尤为重要。信号转导和转录激活因子（signal transduction and activator of transcription,STAT） 是 与靶基因调控区DNA 结合的新型转录因子家族。 在介导多种细胞因子及趋化因子的信号转导中发 挥着重要作用。STAT6 是STAT 家族成员之一，近 年来发现STAT6 在哮喘的发生发展中起到重要作 用；血清类黏蛋白1 样蛋白3（orosomucoid 1-like 3,ORMDL3）基因是与儿童哮喘的发生有密切关 系的哮喘易感基因[1]，其编码位于内质网上由153 个氨基酸组成的跨膜蛋白，目前ORMDL3 与气道 重塑的关系仍不明了；本研究探讨哮喘小鼠气道 重塑中STAT6 和ORMDL3 表达情况和布地奈德 （budesonide,BUD）的干预作用，为临床治疗提供 依据。

1　材料与方法
1.1　实验动物及分组

SPF 级4~6 周龄BALB/c 雌性小鼠30 只，体 重20~25 g，购于河南省动物实验中心，遵照随机 数字法分为对照组、哮喘组、BUD 干预组，每组 各10 只。

1.2　主要试剂

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OVA） 购于美国 Sigma 公司，BUD 混悬液购于阿斯利康公司， ELISA 试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司， TRIzol、反转录试剂盒及PCR 试剂盒均购于法国 Transgene 公司。

1.3　哮喘模型制备及干预

参照Yang 等[2] 报道的制备哮喘小鼠模型的 方法并略加改进，哮喘组和BUD 组小鼠分别于 第1、8、15 天腹腔内注射OVA- 氢氧化铝混悬液 0.2 mL（其中OVA 20 μg，氢氧化铝2 mg）致敏各 1 次，对照组应用生理盐水0.2 mL 替代致敏液行 腹腔注射。从第22 天开始激发，哮喘组和BUD 组 应用1%OVA 5 mL 雾化吸入，每次30 min，每天1 次，共14 d；BUD 组在每次激发前30 min 应用生 理盐水溶解的BUD 雾化液5 mL（含BUD 1 mg） 进行雾化治疗[3]；对照组应用生理盐水5 mL 替代 1%OVA 进行雾化吸入。抗原激发后小鼠出现打喷 嚏、烦躁不安、呼吸加快、抓耳挠腮、竖毛等表 现提示哮喘模型成功。

1.4　标本制作

参照文献[4]，各组小鼠分别在末次激发后 24 h 内，乙醚麻醉，开胸结扎左肺门，取左肺至 于液氮中保存，用于RT-PCR 及ELISA 检测，经 右心室插管至肺动脉，应用生理盐水对右肺进行 匀速灌注、冲洗至肺组织变为白色，然后应用4% 甲醛进行内固定，取右肺中叶浸入4% 的甲醛中行 外固定24 h，石蜡包埋，3 μm 切片，行苏木精- 伊红（HE）染色和Masson 染色，于400 倍光镜下 观察气道壁病理学改变。

1.5　ELISA 法检测肺组织IL-13 水平

称取各组小鼠肺组织，加入适量生理盐水冰 浴下用匀浆器制成匀浆，4 000 r/min 离心10 min， 取上清。考马斯亮蓝法（Bradford）检测肺组织匀 浆中总蛋白含量。采用ELISA 法检测肺组织匀浆 中IL-13 含量，操作过程按ELISA 试剂盒说明进行。 所测IL-13 含量用肺组织匀浆的总蛋白含量校正。

1.6　RT-PCR 检测STAT6 和ORMDL3 mRNA 表 达的变化

采用TRIzol 提取各组小鼠肺组织总RNA，用 反转录试剂盒反转录为cDNA，设计引物并扩增目 的基因片段。STAT6 上游引物：5'-ACGGCTCTATGTTGACTTTC- 3'，下游引物：5'-AGATGCTGTTTCCCTTCC- 3'，片段长度：185 bp；ORMDL3 上游引物： 5'-TGTTGGCTTGTTTACCCTC-3'，下游引物：5'-CCCTTGCTCAGAACTCCC- 3'，片段长度：327 bp；以 GAPDH 作为内参， 上游引物：5'-CCACTTGAAGGGTGGAGC- 3'，下游引物：5'-TGAAGTCGCAGGAGACAA- 3'， 片段长度：530 bp。反应体系为 50 μL， 其中cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、 缓冲液（ 含Mg2+） 5 μL、dNTPs 4 μL、DNA 聚 合酶1 μL、ddH2O 36 μL。反应条件：94 ℃ 预 变性3 min；94 ℃ 变性30 s，57 ℃（STAT6）/ 55 ℃（ORMDL3、GAPDH） 退火30 s，72 ℃ 延 伸1 min，共35 个循环；72℃延伸10 min。扩增 后产物在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳，采用凝 胶电泳成像系统分别测定STAT6、ORMDL3 和内 参GAPDH 的灰度值， 并以STAT6、ORMDL3 与 GAPDH 的比值作为其mRNA 的表达水平。

1.7　统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件包对数据进行统计学 分析，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示， 多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两 两比较采用LSD-t 法；两个因素之间相关性采用 Pearson 相关分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　小鼠肺组织病理学改变

对照组小鼠气道壁结构完整，厚度正常，上 皮细胞排列正常，可见少量胶原纤维。哮喘组气 道结构紊乱，表现为明显的支气管壁增厚、杯状 细胞化生、黏液分泌增多、胶原纤维增生，可见 大量炎性细胞浸润。BUD 组气道结构紊乱情况较 哮喘组减轻，炎性细胞较哮喘组减少。见图 1。

图 1 各组小鼠气道组织病理学变化　　 （×400） 苏木精- 伊红染色结果示：对照组气道壁厚度正常，可见散在 炎症细胞；哮喘组气道壁增厚，可见大量炎性细胞浸润；BUD 组气道壁厚度较哮喘组减轻，炎性细胞较哮喘组减少。Masson 染色结果示：对照组上皮细胞下可见少量胶原纤维；哮喘组上皮细胞下可见较多胶原纤维；BUD 组胶原纤维较哮喘组明显减少， 图中胶原纤维显蓝色。
2.2　STAT6 和ORMDL3 mRNA 及IL-13 在各组 小鼠肺组织中的表达比较

哮喘组小鼠肺组织中IL-13 水平及STAT6 和 ORMDL3 mRNA 的表达均明显高于BUD 组及对照 组（均P<0.05），同时BUD 组肺组织中IL-13 水 平及STAT6 和ORMDL3 mRNA 的表达亦均明显高 于对照组（均P<0.05），见表1，图 2~3。

表 1各组小鼠肺组织中IL-13 水平以及STAT6 和 ORMDL3 mRNA 表达比较　（x±s）

图 2RT-PCR 检测各组小鼠肺组织STAT6 mRNA 的 表达变化　　 1：对照组；2：哮喘组；3：BUD 组。

图 3 RT-PCR 检测各组小鼠肺组织ORMDL3 mRNA 的表达变化　　 1：对照组；2：哮喘组；3：BUD 组。
2.3　相关分析

哮喘组STAT6 mRNA 及ORMDL3 mRNA 的表 达水平呈正相关（r=0.676，P=0.032）。

3　讨论

支气管哮喘以气道高反应、气道炎症及气道 重塑为主要表现。气道重塑主要病理特征包括气 管平滑肌增厚、上皮下纤维化、粘液腺的增生、 新生血管的形成等。既往认为气道重塑发生于重 度哮喘或哮喘病程晚期，有研究显示在轻度患者 及儿童哮喘的早期就存在气道重塑[5]。气道重塑是 不可逆的气道结构改变，因此如何早期控制气道 重塑是目前研究的重点。本实验应用OVA 连续激 发14 d 制备哮喘模型，哮喘组病理学改变可见气 道壁厚度增加、炎症细胞增多、气道上皮下胶原 纤维沉积，提示成功建立气道重塑模型。

STAT 是一种能与靶基因调控区DNA 结合 的新型转录因子家族。多种细胞因子通过JAK/ STAT6 途径而诱导目的基因表达，发挥其生物学 作用。STAT6 是Th2 型淋巴细胞特异性转录因子， 可被IL-4、IL-13 等激活后促使Th2 细胞的增殖、 分化，同时促进释放IL-4、IL-5、IL-13 等多种Th2 型细胞因子，导致Th2 细胞功能亢进，而Th1/Th2 细胞亚群功能失衡是引起哮喘发病的主要原因[6]。 Blease 等[7] 证明与野生型小鼠（STAT6+/+）相比， 基因敲除小鼠（STAT6-/-）产生Th2 型细胞因子的 功能降低，同时气道高反应性明显减轻。本研究 中哮喘组IL-13 水平及STAT6 mRNA 的表达较对 照组增高。推断经过过敏原反复刺激后小鼠体内 IL-13 分泌增加，进而激活JAK/STAT6 途径，上调STAT6 的表达，促进粘液分泌、平滑肌细胞增生、 胶原的生成，参与气道重塑。

ORMDL3 基因是2007 年定义的与儿童哮喘的 发生有密切关系的易感基因，定位于17 号染色体 长臂21 号位（17q21）上，其编码位于内质网膜 的跨膜蛋白，但是其功能及参与哮喘的机制目前 还尚不清楚。已有研究证明ORMDL3 在炎症性肠 病[8]、I 型糖尿病[9] 等发病机制中起到重要作用， 表明ORMDL3 可能参与了免疫系统失调。应用过 敏原和细胞因子（IL-4 或IL-13）刺激气道上皮细 胞后ORMDL3 mRNA 的表达增加[10]。ORMDL3 的 表达产物可以抑制内质网的Ca2+ATP 酶（SERCA） 活性并导致内质网中Ca2+ 浓度减少，同时增加非 折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）[11, 12]。 研究显示内质网中钙泵调节异常可能是平滑肌过 度释放与气道重塑有关细胞因子的基础[13]；UPR 为一种内源性炎症途径，可激活NF-κB 信号通 路，而受NF-κB 调控的基因产物囊括了大多数参 与哮喘气道炎症及重塑的主要细胞因子和炎症介 质[14]。本研究结果显示哮喘组IL-13 水平及 ORMDL3 mRNA 较对照组增高，推断IL-13 可能通 过激活气道上皮细胞的内质网系统，导致ORMDL3 及其表达产物增加，释放细胞因子及炎症介质参 与气道重塑。Miller 等[10] 发现ORMDL3 表达高 度依赖STAT6 水平，Qiu 等[15] 证明STAT6 调控 ORMDL3 的表达，也可能通过激活JAK/STAT6 信 号通路上调ORMDL3 的表达。

本实验结合病理学哮喘组气道结构改变， RT-PCR 结果显示STAT6 和ORMDL3 mRNA 表达 较对照组升高，且二者呈正相关，推断STAT6 和 ORMDL3可能共同参与了哮喘小鼠气道重塑过程， 且二者起协同作用。BUD 为吸入性糖皮质激素， 是目前治疗哮喘的有效药物，副作用较全身应用 糖皮质激素少。BUD 组STAT6 及ORMDL3 mRNA 表达较哮喘组降低，BUD 可能通过下调STAT6 及 ORMDL3 的表达减轻气道重塑。可能的原因有： （1）BUD 可能通过抑制IL-13 的表达，直接下调 STAT6、ORMDL3 表达。（2）BUD 可能通过抑 制IL-13 的分泌，间接抑制JAK/STAT6 通路，下 调STAT6、ORMDL3 的表达。（3）BUD 在体内对 STAT6 及ORMDL3 的表达有直接调控作用。

参考文献
[1] Moffatt MF, Kabesch M, Liang L, et al. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma[J]. Nature, 2007, 448(7152): 470-473.
[2] Yang G, Volk A, Petley T, et al. Anti-IL-13 monoclonal antibody inhibits airway hyperresponsiveness, inflammation and airway remodeling[J].Cytokine, 2004, 28(6): 224-232.
[3] 卞芳芳, 王军, 路名明, 等. RORrt 在支气管哮喘小鼠肺组 织中的表达及BUD 对其抑制作用[J]. 中国当代儿科杂志, 2012, 14(8): 628-631.
[4] 栾斌, 王亚哲, 张艳丽, 等. 1, 25-(OH)2D3 对哮喘小鼠肺内 TIM-4 表达的影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2013, 15(1): 67-70.
[5] Malmstrom K, Pelkonen AS, Malmberg LP, et al. Lung function, airway remodeling and inflammation in symptomatic inflants:outcome at 3 years[J]. Thorax, 2011, 66(2): 157-162.
[6] Goleva E, Hauk PJ, Boguniewicz J, et al. Airway remodeling and lack of bronchodilator response in steroid-resistant asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2007, 120(5): 1065-1072.
[7] Blease K, Schuh JM, Jakubzick C, et al. Stat6-deficient mice develop airway hyperresponsiveness and peribronchial fibrosis during chronic fungal asthma[J]. Am J Pathol, 2002, 160(2): 481-490.
[8] Barrett JC, Hansoul S, Nicolae DL, et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease[J]. Nat Genet, 2008, 9(8): 955-962.
[9] Barrett JC, Clayton DG, Concannon P, et al. Genome-wide association study and meta-analysis find that over 40 loci affect risk of type 1 diabetes[J]. Nat Genet, 2009, 9(6): 703-707.
[10] Miller M, Tam AB, Cho JY, et al. ORMDL3 is an inducible lung epithelial gene regulating metalloproteases, chemokines, OAS, and ATF6[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(41): 16648-16653.
[11] Cantero-Recasens G, Fandos C, Rubio-Moscardo F, et al. The asthma-associated ORMDL3 gene product regulates endoplasmic reticulum-mediated calcium signaling and cellular stress[J]. Hum Mol Genet, 2010, 19(1): 111-121.
[12] McGovern DP, Gardet A, Torkvist L, et al. Genome-wide association identifies multiple ulcerative colitis susceptibility loci[J]. Nat Genet, 2010, 9(4): 332-337.
[13] Mahn K, Hirst SJ, Ying S, et al. Diminished sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) expression contributes to airway remodelling in bronchial asthma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(26): 10775-10780.
[14] 陶莉, 等. 内质网应激在酒精性肝病中的作用[J]. 临床肝胆 病杂志, 2013, 29(7): 547-549.
[15] Qiu R, Yang Y, Zhao H, et al. Signal transducer and activator of transcription 6 directly regulates human ORMDL3 expression[J]. FEBS J, 2013, 280(9): 2014-2026.