中国当代儿科杂志  2014, Vol. 16 Issue (2): 203-207   PDF    
引用本文
刘伟, 李文斌, 常立文等.胰岛素样生长因子-1对新生大鼠神经细胞氧化损伤保护作用的研究[J]. 中国当代儿科杂志, 2014, 16(2): 203-207.  
LIU Wei, LI Wen-Bin, CHANG Li-Wen et al. Protective effects of IGF-1 on cortical nerve cells of neonatal rats under oxidative stress[J]. CJCP, 2014, 16(2): 203-207.   
胰岛素样生长因子-1对新生大鼠神经细胞氧化损伤保护作用的研究
刘伟,李文斌,陈治军,容志惠,常立文     
华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科, 湖北 武汉 430030
收稿日期：2013-5-16，修改日期：2013-12-19
基金项目：国家自然科学基金青年项目（编号：81000261）；2011 国家临床重点专科建设项目。
作者简介：刘伟，男，博士，主治医师。
通讯作者：常立文，女，教授。
摘要：目的 探讨氧化应激状态下，胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对新生大鼠神经细胞氧化损伤的保护作用。方法 原代培养新生大鼠大脑皮层神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞，不同浓度H2O2（0~60 μM）诱导氧化应激细胞模型，LDH 法检测各种神经细胞损伤程度，MTT 法检测各种神经细胞活力；不同浓度H2O2（0~80 μM）诱导氧化应激神经元细胞模型，Western blot 检测IGF-1（25 ng/mL）施加前后神经元细胞内Akt 的磷酸化水平。结果 与未经H2O2 处理组相比，不同浓度H2O2 处理细胞24 h 后，大脑皮层神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞损伤程度均有升高、细胞活力均有降低；但神经元变化更为显著，与少突胶质细胞和星形胶质细胞相比，差异有统计学意义（均P<0.01）；不同浓度的H2O2 处理大脑皮层神经元5 min 后，相比于未经H2O2 处理组，可见Akt 磷酸化水平呈H2O2 浓度依赖性降低（均P<0.01），而在上述处理基础上加入25 ng/mLIGF-1 后，IGF-1 能够逆转低浓度H2O2 导致的神经元细胞Akt 磷酸化，与未经H2O2 处理组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但是对高浓度H2O2 导致的Akt 磷酸化作用无明显效果，其磷酸化水平均低于未经H2O2 处理组（均P<0.01）；经不同浓度的H2O2 处理1 h 后，再加入25 ng/mL 的IGF-1，IGF-1 处理前后Akt 磷酸化水平均已恢复至未经H2O2 处理时的水平（均P>0.05）。结论 大脑皮层神经元对H2O2 诱导的氧化应激损伤较其他神经细胞敏感；IGF-1 对皮层神经元氧化应激损伤具有保护作用。
关键词： 氧化应激     胰岛素样生长因子-1     神经细胞     新生大鼠    
Protective effects of IGF-1 on cortical nerve cells of neonatal rats under oxidative stress
LIU Wei ,LI Wen-Bin, CHEN Zhi-Jun, RONG Zhi-Hui, CHANG Li-Wen     
Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Abstract: Objective To investigate the protective effects of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) on the nerve cells of neonatal rats under oxidative stress. Methods Primary cortical neurons, oligodendrocytes, and astrocytes from newborn rats were cultured. An oxidative stress model was established with different concentrations of H2O2 (0-60 μmol/L); the degree of damage of nerve cells was evaluated by lactate dehydrogenase assay, and the viability of nerve cells was tested by MTT assay. An oxidative stress model was established with different concentration of H2O2 (0-80 μmol/L). Expression of Akt/p-Akt (Ser473) in neurons was measured by Western blot before and after IGF-1 (25 ng/mL) administration. Results Compared with those not treated with H2O2, the cortical neurons, oligodendrocytes, and astrocytes treated with different concentrations of H2O2 for 24 hours showed increased damage and decreased cell viability; compared with oligodendrocytes and astrocytes, neurons showed significantly more changes (P<0.01). Compared with those not treated with H2O2, the cortical neurons treated with different concentrations of H2O2 for 5 minutes showed a significant decrease in p-Akt (Ser473) level (P<0.01), which was dependent on the concentration of H2O2. For the neurons treated with low-concentration H2O2, the addition of IGF-1 could reverse the inhibition of Akt phosphorylation, eliminating the difference in p-Akt level compared with the neurons not treated with H2O2, (P>0.05); however, it had no significant effect on the inhibition of Akt phosphorylation by high-concentration H2O2, and the treated neurons still had a lower p-Akt level than untreated neurons (P<0.01 for all). For the cortical neurons that had been treated with different concentration of H2O2 for 1 hour, the addition of IGF-1 (25 ng/mL) could eliminate thedifference in p-Akt level between the treated neurons and untreated neurons (P>0.05). Conclusions Cortical neurons are more sensitive to oxidative stress induced by H2O2 than other nerve cells. IGF-1 has protective effects on cortical nerve cells under oxidative stress.
Key words: Oxidative stress     IGF-1     Nerve cell     Neonatal rats    

哺乳动物的神经细胞在有氧代谢的过程中 不断产生过氧化物，其中间降解产物为过氧化 氢（H2O2），属活性氧族（ROS）。生理浓度的 H2O2 对于细胞信号的传导是必要的[1]，然而高浓 度的H2O2 通过产生氧自由基诱导氧化应激，如不 及时清除，将导致神经细胞的损伤和死亡[2]。胰岛 素样生长因子-1（IGF-1）是一种多肽类神经营养 因子，它对哺乳动物神经系统的发育至关重要[3]。 IGF-1 及其受体的表达在神经分化过程中达到顶 峰，IGF-1 通过激活其受体，促进神经细胞生存、 分化、增殖、突触外伸以及髓鞘形成[4]，IGF 系统 对活体动物神经细胞的生存和增殖十分重要[5]。 本实验室前期的研究证明，ROS 可诱导神经细胞 产生IGF-1 抵抗，从而使IGF-1 对神经细胞的保护 作用大打折扣[6]。那么，本实验中将进一步探讨 IGF-1 对氧化应激后神经细胞保护作用是否存在时 间窗。

1　材料与方法

IGF-1 购自澳大利亚Gropep 公司；LDH 试剂 盒购自美国Promega 公司；H2O2、血小板衍生生 长因子、胰酶抑制剂、B27、DMSO、胎牛血清、 DNA 酶I、多聚赖氨酸、TEMED、过硫酸胺、 吐温-20 和MTT 试剂均购自美国Sigma 公司；NeuN 单克隆 抗体购自美国Millipore 公司；P-Akt（Ser473）、 Akt、GFAP 单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司；APC（cc-1） 单克隆抗体购自 美国Calbiochem 公司；0.25% 胰酶、0.05% 胰 酶-EDTA、DMEM 培养基、Neurobasal A 培养基、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和谷氨酰胺购 自美国Invitrogen 公司。

1.2　新生大鼠皮层神经细胞原代培养及鉴定

新生大鼠皮层神经元细胞、少突胶质细胞、 星型胶质细胞原代培养技术按本实验室建立的 方法[7] 操作。NeuN 是神经元细胞中的标志性蛋 白，APC（cc-1）是少突胶质细胞的标志性蛋白， GFAP 是星型胶质细胞的标志性蛋白，采用免疫细 胞化学SP 法分别对各标志性蛋白表达进行检测（工 作液浓度为1 : 200），以鉴定不同细胞。

1.3　LDH 法检测细胞的损伤程度

吸弃接种于48 孔细胞培养皿中的上清，用 高糖DMEM 清洗细胞1 遍，更换培养液为高糖 DMEM，分别给予细胞不同浓度（0、40、60 μM） H2O2 处理24 h，每个浓度处理组设4 个复孔，采用 LDH 检测试剂盒对细胞的损伤程度进行检测，操作 步骤严格按照试剂盒说明书进行。实验重复3 次。

1.4　MTT 法检测细胞活力

用PBS 配制终浓度为10 μg/μL 的MTT 液，调 pH 值为7.4，注意避光。吸弃接种于48 孔细胞培 养皿中的上清，用高糖DMEM 清洗细胞1 遍，更 换培养液为高糖DMEM，分别给予细胞不同浓度 （0、40、60 μM）H2O2 处理24 h，每个浓度处理 组设4 个复孔，避光条件下每孔加入10 μg/μL 的 MTT 5 μL，37℃孵育4 h，吸弃培养上清液，每孔 加入250 μL DMSO，摇晃5 min，充分溶解，酶联 免疫检测仪，570 nm 处读取吸光度（OD）值。实 验重复3 次。

1.5　Western blot 检测细胞裂解液中P-Akt （Ser473）及Akt 的表达

待经鉴定后的原代新生大鼠皮层神经元细胞 生长至亚融合状态（约第6~7 天）时，吸弃细胞 培养皿中的上清，用高糖DMEM 清洗细胞1 遍， 更换培养液为高糖DMEM，分别给予细胞0~80 μM 浓度的H2O2 处理不同时间，再次更换培养液为新 鲜高糖DMEM 后，随机分为对照组和IGF-1 干预组， 向IGF-1 干预组中加入25 ng/mL 的IGF-1，对照组 不做任何处理，两组于45 min 后提取蛋白检测相 应各指标变化，整个过程不再更换培养液。每个不 同浓度亚组平行提取3 个蛋白样本，实验重复3 次。 参考文献[6] 裂解细胞提取蛋白，按每泳道 加总蛋白20 μg 进行SDS-PAGE 凝胶电泳，湿式 电转移至硝酸纤维素滤膜上，室温封闭30 min， 加入相应的P-Akt（Ser473） 或Akt 单克隆抗体 （1 : 1 000）4℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入 相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1 : 2 000）， ECL 增强化学发光显色系统（Thermo Scientific） 显色5 s~5 min。应用GDS-8000 型凝胶成像分析系 统（UVP，England）扫描并进行半定量分析。

1.6　统计学分析

采用SPSS 15.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，多 组均数间的比较采用方差分析，组间两两比较采 用LSD-t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　不同浓度H2O2 对新生大鼠神经元、少突胶 质细胞及星形胶质细胞损伤的影响

与未经H2O2 处理组相比，H2O2（40、 60 μM）处理细胞24 h 后，大脑皮层神经元、少突 胶质细胞及星形胶质细胞上清液中LDH 活性均有 升高；但神经元细胞上清液中LDH 活性升高更为 显著，与少突胶质细胞和星形胶质细胞相比，差 异有统计学意义（均P<0.01）见图 1。

图 1　LDH 法检测不同浓度H2O2 对新生大鼠神经元、 少突胶质细胞及星形胶质细胞损伤程度的影响　　 注：a 为 与未经H2O2 处理组比较，P<0.05；b 为与同浓度H2O2 处理的少突 胶质细胞或星形胶质细胞比较，P<0.01（n=4）。
2.2　不同浓度H2O2 对新生大鼠神经元、少突胶 质细胞及星形胶质细胞活力的影响

与未经H2O2 处理组相比，H2O2（40、 60 μM）处理细胞24 h 后，大脑皮层神经元、少 突胶质细胞及星形胶质细胞活力均有下降；但神 经元细胞活力下降更为显著，与少突胶质细胞 和星形胶质细胞相比，差异有统计学意义（均 P<0.01）见图2。

图 2 　MTT 法检测不同浓度H2O2 对新生大鼠神经元、 少突胶质细胞及星形胶质细胞活力的影响　　 注：a 为与未 经H2O2 处理组比较，P<0.05；b 为与同浓度H2O2 处理的少突胶质 细胞或星形胶质细胞比较，P<0.01（n=4）。
2.3　H2O2 对新生大鼠皮层神经元Akt 磷酸化的抑 制作用

在新生大鼠皮层神经元中施加不同浓度的 H2O2 处理5 min，相比于未经H2O2 处理组，可见 Akt（Ser473）磷酸化水平呈H2O2 浓度依赖性降低 （均P<0.01）；而经不同浓度的H2O2 处理1 h 后， Akt（Ser473）磷酸化活性全部恢复至未经H2O2 处 理组水平（均P>0.05）。见图3。

图 3 两组治疗前后预测成年身高及接近成年身高的比较 PAHBA0指治疗前预测成年身高，PAHBA1指治疗后停药时预测成年身高，NAH指观察结束时接近成年身高。
2.4　IGF-1 对H2O2 导致的Akt 磷酸化的影响 在新生大鼠皮层神经元中不同浓度的H2O2 处理5 min， 换液后加入25 ng/mL 的IGF-1 处理 45 min，结果表明，IGF-1 能够逆转低浓度H2O2 （10、20 μM） 导致的Akt（Ser473） 磷酸化， 与未经H2O2 处理组比较， 差异无统计学意义 （ 均P>0.05）， 但是对高浓度H2O2（40、60、 80 μM）导致的Akt（Ser473）磷酸化作用无明显 效果，其磷酸化水平均低于未经H2O2 处理组（均 P<0.01）；而经不同浓度的H2O2 处理1 h，换液后 加入25 ng/mL 的IGF-1 处理45 min，Akt（Ser473） 磷酸化活性与未经H2O2 处理组比较差异均无统计 学意义（均P>0.05）。见图4。
图 4 两组治疗前后预测成年身高及接近成年身高的比较 PAHBA0指治疗前预测成年身高，PAHBA1指治疗后停药时预测成年身高，NAH指观察结束时接近成年身高。
3　讨论

在目前神经变性疾病的研究中，氧化应激导 致细胞死亡的机制尤为重要[8]。氧化应激被定义为 ROS 的产生和清除持续失衡。在生理条件下，作 为调控自身氧化还原状态的手段，细胞能够精密 的控制内源性的ROS 水平[9]，由ROS 产物介导的 细胞死亡很大程度上是由于干扰了调控机制。细 胞内生理剂量下的ROS 对于多种信号通路的传导 是必须的，然而过量的ROS 则可从生理状态转化 为氧化应激从而介导细胞死亡。大脑皮层主要由 神经元细胞和神经胶质细胞构成，其中胶质细胞 主要包括星型胶质细胞及少突胶质细胞。神经元 细胞是最重要的皮层功能细胞，它对氧化应激等 损伤尤为敏感，是氧化应激所致脑损伤的主要靶 细胞[10]。本实验研究表明高浓度的H2O2 对星型胶 质细胞及少突胶质细胞的损伤作用均不明显，而 对神经元细胞则会产生明显损伤。说明神经系统 在氧化应激状态下，恰好是其最重要的功能细胞－ 神经元细胞受损最重，这也正好解释了为什么氧 化应激会导致中枢神经系统的严重损伤。

本研究着眼于ROS 对IGF-1 信号的影响和其 在神经细胞死亡中扮演的角色。因为IGF-1 神经 营养通路中有许多组分都对细胞的氧化还原状态 十分敏感，它们极易被过量的ROS 影响。研究表 明，缺氧缺血发生后，循环中IGF-1 水平降低且神 经细胞表达IGF-1 下降，使不成熟神经细胞的生存 和成熟缺乏必要的营养支持[11]，理论上此时立即 补充外源性的IGF-1 有效。然而在新生大鼠动物模 型，即使在缺氧缺血发生后立即心腔内注射大剂 量的IGF-1，3 d 后其脑损伤仅能减少40% 左右[12]； 而在缺氧缺血后恢复期的24 h 和48 h 皮下注射 IGF-1 则可显著减轻缺氧缺血诱导的不成熟鼠脑损 伤，并且在2 个月后明显改善它们的记忆和认知 行为发展[13]。这些新的发现提出一个问题，为什 么在缺氧缺血发生后立即给予IGF-1 治疗反而不如 延迟治疗效果明显？那么，我们有理由猜测IGF-1 的治疗作用存在一个时间窗。Akt 作为一种众所周知的致存活因子，对神经细胞的生存和功能成熟 是必须的。研究表明，大多数的神经变性疾病均 与Akt 的缺乏有关，本实验也发现：当缺氧缺血 发生后，Akt 的激活受到抑制，若立即施予IGF- 1，此时存在的急性氧化应激将诱导神经细胞发生 IGF-1 抵抗，Akt 无法激活，故IGF-1 治疗效果不佳； 而在其恢复期，Akt 的活性得以恢复，可被重新激 活，神经细胞又逐渐恢复对IGF-1 的敏感性，此时 再施予IGF-1，则可大量激活Akt 以发挥其最佳神 经保护作用。这些研究结果证实：IGF-1 对皮层神 经元细胞氧化应激损伤的保护作用存在时间窗。 这些发现或将为临床上选择最佳的神经细胞保护 药物干预时间提供理论依据。

志谢：本实验大部分内容在美国印弟安那州立大 学医学院儿科Wei-Hua Lee 教授实验室完成，衷心感谢 Wei-Hua Lee 教授给予的指导和帮助。

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