胃黏膜具有阻止各种物理和化学物质损伤的 御机制，包括黏液- 碳酸氢盐屏障、黏膜屏幕、 膜血流和上皮细胞更新。胃黏膜屏障主要由上 细胞及细胞间连接组成，可有效防止H+ 的反向 散，阻止大分子入侵，是防止有害微生物经胃 入机体的第一道防线^{[1, 2]}。细胞间连接是由紧密 接、黏附连接、缝隙连接和桥粒等组成。紧密 接是细胞连接结构中最重要的一种膜蛋白复合 ，位于靠近顶端的细胞侧面，呈连续串珠状， 连接相邻的细胞。一旦紧密连接受损，上皮细胞 间的通透性增加，细菌、内毒素等就可通过紧密 连接进入机体，这与多种疾病的发生发展有关， 包括胃肠道肿瘤^{[1, 2]}。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺 癌和黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤密切相关，但其 发病机制尚不清楚^{[3, 4]}。研究表明，Hp 产生的毒素 和有毒素作用的酶能破坏胃黏膜屏障，还能使机 体产生炎症和免疫反应，导致疾病的发生^[5]。儿童是Hp 的易感人群，Hp 感染率随着年龄的增长而 增加，并与经济卫生条件、生活习惯和家庭聚集 性有关,而成年期的Hp 感染往往起始于儿童期^{[6, 7]}。 目前认为，Hp 感染后胃上皮紧密连接受损在Hp 相关性胃病的发病中起着重要的作用，本文就紧 密连接蛋白与Hp 感染相关性胃病的关系研究作一 综述。 1　紧密连接蛋白的组成及功能

紧密连接由多种蛋白及分子组成，包括3 种 完整的膜蛋白，即咬合蛋白（occludin）、闭合蛋 白（claudin）和连接黏附分子（junctional adhesion molecule,JAM）；1 种胞浆蛋白，即闭合小环蛋 白（zonula occludens,ZOs）。目前认为， 起主要 作用的紧密连接蛋白为occludin 和claudin，尤以 claudin 的功能最为重要，它是构成紧密连接的主 要骨架蛋白^[2]。Claudin 可通过细胞屏障、细胞旁 路转运和信号转导保持细胞内环境的平衡，其异 常表达可导致上皮细胞的结构破坏及功能受损， 导致疾病的发生。 1.1　Occludin

Occludin 是第1 个发现的定位于紧密连接的 跨膜蛋白，相对分子质量为65 000，基因定位于 染色体5q13.1，具有两个细胞外环，有2 种不同 的亚型^[8]。Occludin 具有调节细胞黏附、维持细胞 极性的作用，它在紧密连接复合体上的定位和功 能是通过磷酸化过程来调节的^[9]。Occludin 可能 是GTPases 信号传导通路的初始受体，磷酸化的 occludin 可调节紧密连接的渗透性，而与细胞支架 蛋白的活动无关。Occludin 可激活一些抑癌基因 （p16INK4A）的表达，抑制肿瘤的进一步发展^[10]。 在多数肿瘤的发生和发展过程中，occludin 表达降 低或缺失，可激活Ras 等癌基因的表达，促使肿 瘤的发生，提示occludin 与肿瘤发生、发展和转移 密切相关。 1.2　Claudin

Claudin 是由24 种跨膜蛋白组成的超家族， 相对分子质量约为20 000~27 000，可直接形成紧 密连接带。每个claudin 分子在细胞外有2 个环状 结构，第1 个环比第2 个环大，并有较强的疏水 性^[11]。Claudin 家族各成员通过其同嗜性和异嗜性 将相邻细胞连接在一起，使得紧密连接结构和功 能呈现多样化。在紧密连接蛋白中，claudin 是旁 细胞转运途径的主要决定因素，通过大小选择性 和电荷选择性介导细胞间的物质转运^[12]。Claudin 作为细胞旁质子屏障可以调节胃上皮离子通道的 动态平衡，claudin-18 的缺失可引起细胞旁H+ 渗 漏及萎缩性胃炎^{[13, 14]}。Claudin 蛋白胞浆区的G- 端 区包含几个磷酸化位点，是由一些蛋白激酶如丝 裂原活化蛋白激酶和依赖环磷酸腺苷（cAMP）的 蛋白激酶调节，通过磷酸化导致一些claudin 蛋白 从紧密连接中丢失，可致紧密连接功能严重受损， 进而增加了细胞旁通透性^[15]。

蛋白激酶C（PKC）是一组丝氨酸- 苏氨酸蛋 白激酶，其活化对claudin 的表达、定位、磷酸化 等具有不同影响，继而影响上皮细胞屏障功能^[16]。 Aono 等^[17] 发现新型PKC 可以磷酸化claudin-4， 磷酸化位点的氨基酸突变后不仅claudin-4 不能被 磷酸化，紧密连接的形成也受到的严重干扰。蛋 白激酶A（PKA）可由cAMP 激活，对紧密连接 装配及上皮细胞的细胞旁通路的开放具有调节作 用^[18]。以点突变技术使claudin-1 的PKA 磷酸化位 点缺失可使claudin-1 转移入细胞核，提示PKA 可 通过磷酸化作用调控claudin-1 的细胞内定位^[19]。 MAPK 信号通路可磷酸化多种胞质蛋白和核蛋白， 能通过上调或下调紧密连接蛋白的表达调控紧密 连接的细胞旁转运，改变紧密连接的分子组成^[18]。 Rho 激酶（ROCK）接受由Rho 转导的活化信号后， 发生多个氨基酸位点的磷酸化而激活，参与紧密 连接功能的调节^[20]。 1.3　ZO 蛋白

紧密连接的组装和细胞屏障通透性的维持依 靠膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族的ZO 蛋白， 常见的有ZO-1、ZO-2 和ZO-3 蛋白。ZO 蛋白含有 特征性的PDZ 结构域、SH3 结构域和鸟苷酸激酶 （GUK）结构域，与紧密连接和细胞骨架肌动蛋白 相连^[21]。ZO-1 是紧密连接的支架蛋白，可通过α-、 β- 连接蛋白（catenins）连接钙黏蛋白cadherin 到 肌动蛋白骨架。Claudin 分子可将occludin 聚集到 紧密连接结构中，并可与ZO-1、ZO-2 和ZO-3 等 结合在一起发挥作用。多数情况下只要ZO-1 受到 破坏，紧密连接的功能大多会随之发生变化，因 此ZO-1 常被作为评估机体内各种组织的紧密连接屏障功能和通透性功能的指标^[8]。 1.4　紧密连接功能

紧密连接主要有两大生物学功能：（1）屏障 功能：紧密连接具有调控离子、溶液等从细胞侧 扩散到另一侧的屏障作用，对维持机体内环境的 稳定和机体正常机能发挥重要作用；（2）栅栏功能： 由于紧密连接连续地环绕在细胞顶端，将上皮细 胞游离端和基底侧膜上的膜蛋白相互隔离，保持 上皮细胞的极性，进而影响细胞的分化与成熟、 细胞信号传导和旁通透性调节，并在防止各种微 生物的入侵和致病中发挥重要作用^{[2, 22, 23]}。 2　紧密连接蛋白与Hp 感染相关性胃病

紧密连接是一个动态的、可以调控的屏障， 紧密连接蛋白的适当表达对维持正常黏膜屏障功 能具有重要意义，其表达异常可致紧密连接结构 和功能异常，黏膜通透性增高，潜在的有害物质 或病原体可进入机体，这是许多疾病发生的基 础^[2]。紧密连接结构和功能受损在Hp 相关性胃病 发病中的作用近年来受到关注。研究表明，Hp 感 染导致慢性胃炎及消化性溃疡，甚至癌变^[3]。在长 期的Hp 感染所致的慢性活动性炎症过程中，通过 一系列的致病因子：如尿素酶、空泡毒素（VacA）、 毒素相关基因蛋白（CagA）、炎性介质等毒性因 子的攻击，导致胃黏膜上皮通透性改变、细胞增殖、 细胞凋亡及一系列组织病理学变化^[3]。 2.1　Hp 毒力因子与紧密连接蛋白

Hp 破坏胃上皮紧密连接为Hp 相关性胃病的 主要发病机制之一。Hp 常黏附在胃上皮细胞的紧 密连接附近，具有Cag A 致病岛的菌株通过IV 型 分泌系统分泌CagA 蛋白入宿主细胞，在酪氨酸位 点上通过Src 家族激酶磷酸化CagA，继而通过调 整细菌黏附附近ZO-1 和JAM 的位置，改变紧密连 接ZO-1 的分布而增加细胞旁通透性^{[24, 25]}。Fedwick 等^[24] 发现Hp 在融合非转化的上皮细胞可破坏 occludin，claudin-4、claudin-5 的形成，直接增加 细胞旁通透性，这个过程并不依赖于Hp 毒力因子 VacA 和CagA。Hp 可引起尿素酶依赖的通透性增 高，表现为紧密连接破坏，肌球蛋白轻链（MLC） 激酶激活后导致的MLC 磷酸化增加。能产生VacA 的Hp 菌株通过增加紧密连接对小离子和小分子的 通透性而调节上皮细胞的完整性^[26]。Fiorentino 等^[27] 报道Hp 可引起极性化的人胃上皮细胞跨膜电阻抗 （TER）下降、通透性增加、紧密连接完整性破坏、 ZO-1 和claudin-1 蛋白的异位和严重缺失。白细胞 介素-1β（IL-1β）是可能破坏上皮屏障结构与功 能的炎症前细胞因子，而IL-1β 的多态性和内源 性IL-1β 受体拮抗剂基因与Hp 相关性胃癌的高 风险密切相关^[28]。Hp 可诱导IL-1 受体磷酸化，从 而激活ROCK，再以ROCK 依赖性方式抑制人单 层胃上皮细胞的claudin-4 表达并影响其在紧密连 接中的分布，破坏胃上皮屏障结构^[20]。 2.2　Hp 感染所致的氧化应激与紧密连接蛋白

氧化应激在胃黏膜损伤和胃癌发生中起着重 要作用。Hp 感染可促使细胞内活性氧的产生， 损伤胃上皮的通透性，这种屏障功能的降低与 紧密连接蛋白的减少是相一致的^{[24, 29]}。过氧化氢 （H₂O₂）可引起胃上皮细胞claudin-3 减少，但对 claudin-4、claudin-7 和JAM-A 无影响^[30]。由于氧 化应激可激活PKA，而claudin-3 可被PKA 磷酸 化，推测氧化应激对胃上皮通透性的损伤可能与 claudin-3 在PKA 的作用下磷酸化，导致紧密连接 强度减低有关^[30]。研究表明，氯吡格雷治疗心脑 血管疾病可引起胃黏膜损伤，其机制可能与通过 激活MAPK 中的ERK 和p38 途径，下调大鼠胃黏 膜上皮细胞间紧密连接蛋白occludin 和ZO-1 表达， 破坏紧密连接复合体，抑制大鼠胃黏膜屏障功能 修复，从而延迟大鼠胃黏膜损伤的愈合有关^{[31, 32]}。 2.3　Hp 感染所致紧密连接结构与功能受损和胃肿 瘤发生

近年来，细胞黏附分子在肿瘤的侵袭、转移 中所起的关键作用已引起普遍关注^{[22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33]}。胃溃疡和 胃癌患者常伴有Hp 感染，Hp 能通过下调紧密连 接蛋白的表达而破坏胃上皮屏障，增加上皮渗透 性，促进胃溃疡恶变和肿瘤进展。近年发现Hp 可 通过激活MLC 激酶使MLC 磷酸化，破坏claudin-4 和claudin-5，引起胃上皮细胞的旁渗透增加， 这可能是Hp 引起消化性溃疡和胃癌的一种机 制^[24]。目前认为，claudin 家族成员是紧密连接的 重要成分，其表达减少降低了细胞间的黏附，增 加了肿瘤细胞的迁移和侵袭性。在许多肿瘤发生 时claudin 表达水平明显下降，有报道胃癌手术患 者肿瘤组织中claudin-4 mRNA 表达较正常胃黏膜组织低下，其低表达与胃癌细胞低分化、浸润深度、 淋巴结和腹膜转移密切相关，其总体生存率也明 显下降^[34]。Jung 等^[35] 报道胃腺癌组织claudin-3 和 claudin-4 的表达明显降低，特别是在有淋巴结转 移的患者，而claudin-4 阳性者比阴性者预后较好。 但在一些肿瘤组织中claudin 表达水平明显较周围 组织增高，且随着肿瘤恶性程度的升高、淋巴结 转移的发生而增加，如胃腺癌组织中claudin-1、 claudin-3、claudin-4 和claudin-7 表达升高， 而 在正常胃组织中表达的claudin-18 则缺失^{[12, 33]}。 Tanaka 等^[15] 发现EphA2 可使claudin-4 的胞浆中C 端区的酪氨酸残基磷酸化，引起claudin-4 分布和 功能异常，导致claudin-4 与ZO-1 结合减弱，破坏 紧密连接结构。由于EphA2 在上皮细胞和许多肿 瘤细胞中都有分布，这可解释claudin-4 在一些肿 瘤细胞包括胃癌中的表达异常。Claudin 的表达无 论高低或是否被磷酸化，均可引起紧密连接屏障 的正常结构破坏而导致细胞间分子异常侧向扩散、 细胞极性消失等一系列变化^[36]。

上皮钙黏附素（E-cadherin）作为一种重要的 钙依赖性黏附分子，在上皮细胞间起着介导同质 性黏附及维持组织结构完整性的作用。E-cadherin 作用的发挥离不开连接蛋白catenin， 主要有 α-catenin、β-catenin 和γ-catenin。E-cadherin 在细胞浆区通过β-catenin 和α-catenin 连接， α-catenin 再和细胞骨架肌动蛋白丝相连，形成 E-cadherin 蛋白复合体而发挥细胞间黏附作用^[37]。 有学者认为，E-cadherin 是肿瘤细胞浸润转移的抑 制剂，E-cadherin 表达下降与肿瘤细胞分化、侵袭 转移密切相关^[38]。Hp 感染可引起E-cadherin 水平 降低，可能通过启动E-cadherin 的甲基化，而与 α6- 整合素及细胞外基质蛋白的改变无关^[38]。Yu 等^[39] 研究提示α-catenin 的缺失或下调表达可能 是胃癌发生的早期事件，α-catenin mRNA 在胃黏 膜的缺失或表达下调与Hp 感染有关。Hp 可激活 胃上皮细胞β-catenin 信号系统，这种β-catenin 激活是依赖于CagA，而与CagA 的酪氨酸磷酸化 无关^{[40, 41]}。研究表明，胃腺癌组织中claudin-7、 claudin-18 和E-cadherin 表达均低于胃正常黏膜组 织，且与患者肿瘤分化程度、淋巴结转移及增殖 细胞核抗原表达相关^[42]。

近年来，关于癌细胞侵袭、转移的机制之一 的上皮- 间充质转化（EMT）已成为研究的热点之 一。EMT 是指具有极性的上皮细胞转换成有活动 能力并具备间质表型的间充质细胞的过程，包含 紧密连接和黏附连接的细胞间连接复合体的重组， 而上皮细胞表型的缺失及间充质细胞表型的获得 是其主要特征^[43]。在上皮肿瘤的发生发展过程中， 紧密连接蛋白表达异常导致EMT；细胞极性功能 紊乱使细胞间的黏附力下降，侵袭性增强；上皮 细胞通透性增加有利于肿瘤细胞摄取丰富的营养 物质，从而促使肿瘤细胞的异常增殖^[44]。ZO-1 与 抑癌基因编码产物同源，其表达水平变化与肿瘤 的发生发展相关，且可能是通过EMT 途径实现 的。有报道ZO-1 在胃癌组织中表达下调，与肿瘤 的临床分期、转移和预后有关^[45]。紧密连接蛋白 ZO-1、ZO-2、ZO-3 除了细胞连接作用外，还可能 涉及到信号传导途径，在一些疾病和癌细胞中可 见其表达异常或表达丢失。Claudin-1、claudin-3、 claudin-4 和claudin-7 在胃癌纵向侵袭转移过程中 呈现异质性表达，其表达变化可能参与胃黏膜的 肠上皮化生、肿瘤细胞的增殖及胃癌侵袭转移过 程中的EMT^{[35, 46]}。 3　增强紧密连接蛋白的功能与Hp 相关性 胃病防治

由于胃上皮紧密连接蛋白与Hp 相关性胃病的 发生和发展密切相关，因此紧密连接蛋白作为Hp 相关性胃病治疗的靶点近来受到关注。Rebamipide 是一种胃黏膜保护剂，主要通过清除自由基、阻 止H₂O₂ 引起的claudin-3 蛋白减少，降低胃上皮 通透性，提高胃屏障功能而达到治疗胃炎和胃溃 疡的目的 ^[30]。Claudin 对紧密连接功能的发挥具 有重要意义，其磷酸化是维持和调节细胞旁通透 性的关键，磷酸化失调可致紧密连接功能严重受 损，因此研究影响claudin 磷酸化调节的因素可为 胃肠屏幕的维持或修复提供新的靶点。植物乳杆 菌可部分恢复PKC 活性和紧密连接蛋白的丝氨酸 磷酸化水平，上调紧密连接蛋白表达并恢复其结 构和分布，提示植物乳杆菌可通过抑制PKC 信号 通路抑制上皮屏障功能的损伤^[47]。Claudin-4 是产 气荚膜梭菌肠毒素（CPE）的受体，由于CPE 结 合claudin-4 后可通过胞膜穿透作用使细胞溶解坏死，这样就可能通过CPE 对高表达claudin-4 的肿 瘤产生特异性的细胞溶解作用，有可能成为治疗 上皮细胞肿瘤的新途径^[48]。另外，ZO-1 的低表达 是促进胃癌细胞侵袭和转移的使动因素之一，那 么能否通过保护ZO-1 蛋白的正常表达，从而减慢 胃癌细胞的侵袭转移？并可进一步从分子水平探 讨ZO-1 的作用机制，为胃癌的基因治疗提供有效 靶点。由于紧密连接蛋白在Hp 相关性胃病发生、 发展中的确切机制尚不清楚，紧密连接蛋白作为 靶点如何起到有效的防治作用尚有待于深入研究。

综上所述，胃上皮紧密连接是维持胃上皮黏 膜屏障的主要成分，其结构和功能受损是Hp 感染 引起相关性胃病的重要机制，如何恢复上皮细胞 间正常紧密连接结构、保持紧密连接的完整性、 增强紧密连接的功能是防治Hp 相关性胃病的重要 研究方向之一。