噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH） 是一种致命的 失控而无效的免疫应答所致的过度炎症反应疾^[1]。该病好发于儿童，表现为T 细胞和巨噬细胞 过度增生和活化，从而导致显著的高细胞因子 症^[2]。该病主要特征是NK 细胞、CD8+ 细胞毒 T 细胞（CTL）毒性功能的下降甚至缺失^[3]。未 经治疗的HLH 是致命的，而即使获得积极的治疗， HLH 死亡率依然很高^[1]。HLH 包括原发性HLH 和继发性HLH 两种形式。原发性HLH 通常发生 于原发基因异常的患者，目前已经证实的9 个相 关基因包括PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、 RAB27A、LYST、AP3B1、SH2D1A 以及XIAP。 其中X 连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor ofapoptosis,XIAP） 基因于2006 年首次被发现与 HLH 有关^[4]。本研究采用直接测序技术，对65 例 HLH 患儿进行XIAP 基因突变筛查，并初步探讨 基因型与临床表现之间的关系。 1　资料与方法 1.1　研究对象

选取2009 年1 月至2012 年12 月于广西医 科大学第一附属医院儿科就诊的HLH 患儿65 例 为研究对象，其中男37 例，女28 例；平均年龄 6±4 岁。HLH 诊断及治疗标准为国际组织细胞协 会推荐的HLH-2004 方案^{[3, 5]}。同时选取于我院行 健康体检的儿童70 例作为对照组，其中男40 例， 女30 例；平均年龄6±3 岁。两组间年龄、性别 比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。 1.2　主要试剂与仪器

QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，德国）； 2×Master Mix（北京天根生化科技公司，中国）； 引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司， 中国）；多通道PCR 扩增仪（PTC-220，美国）； 恒温水浴箱（DK-420，中国）；电泳仪（DYY-86 型， 中国）；Gel Doc EQ 凝胶成像系统（Bio-RAD，美国）； 序列分析仪（ABI3100 Genetic Analyzer，美国）。 1.3　标本采集及基因组DNA 提取

采集两组儿童的外周静脉抗凝血1 mL，按 QIAamp DNA Blood Mini Kit 说明书提取基因组 DNA，于-20℃冰箱保存。 1.4　引物设计

应用Primer 及Oligo 软件对人XIAP 基因序列 （GenBank 序列号：NC_000023.10）进行引物设计， 具体引物序列见表1。

表 1(Table 1)

表1　扩增XIAP 基因的引物序列

表1　扩增XIAP 基因的引物序列

PCR 反应总体积为50 μL， 其中包含 2×Master Mix 25 μL、10 μmol/L 上下游引物各 2 μL、DNA 模板2 μL，加ddH2O 至50 μL。反应条件： 94℃预变性4 min；94℃变性30 s，退火（温度参 照表1）30 s，72℃延伸30 s，共35 个循环；72℃ 再延伸7 min。取5 μL PCR 产物在2% 琼脂糖凝 胶中电泳，条件为100 V 电泳35 min，以1 000 bp DNA Ladder 为相对分子质量标准。将凝胶置于Gel 成像系统进行成像并分析。 1.6　PCR 产物测序

采用序列分析仪（ABI3100 Genetic Analyzer）对 所有PCR 产物进行直接测序，测序结果与人XIAP 基因序列（GenBank 序列号：NC_000023.10）进行 比对。 1.7　统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分 析，基因型和等位基因频率采用率（%）表示，组 间比较采用四格表χ₂ 检验和R×C 列联表χ₂ 检验，

P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　XIAP 基因PCR 产物

XIAP 基因7 个外显子扩增后，经2% 琼脂糖 凝胶电泳后于凝胶成像分析仪观察，可见各外显 子清晰整齐的条带，以DNA marker 为参照，所扩 增的产物均为所需目的条带，见图 1。

图 1　XIAP 基因PCR 扩增产物电泳条带图 M： marker；1~7 分别为外显子1-1、1-2、2~6。

在对XIAP 基因7 个外显子的PCR 扩增产物 进行测序后，用Chromas 软件和GenBank 数据库 中人XIAP 基因序列进行比对，结果全部外显子 编码区均未发现突变点。仅在外显子5 发现1 个 非同义单核苷酸多态性（SNP）位点：rs5956583 （42009A>C）。 2.3　两组rs5956583 基因型频率和等位基因频率 比较

rs5956583 基因型频率和等位基因频率在HLH 患儿和对照组间的分布差异均无统计学意义（均 P>0.05），见表2。

表 2(Table 2)

表2　两组rs5956583 基因型和等位基因频率比较 [ 例（％）]

表 2　两组rs5956583 基因型和等位基因频率比较 [ 例（％）]

XIAP 是凋亡抑制因子家族成员之一，其蛋 白结构包含3 个BIR 区和1 个C 端的RING 区。 XIAP 最主要的生物学功能是抑制caspase 活性而达到抗凋亡的作用。此外，XIAP 还在其它多条信 号通路中发挥作用，例如NF-κB、c-Jun N 端激酶 1、转化生长因子-β、核酸结合齐聚区域蛋白以 及E3 泛素酶活性等^{[6, 7, 8, 9, 10]}。2006 年，Rigaud 等^[4] 首 次报道在HLH 病人中发现XIAP 基因突变。至今 为止全世界共报道49 例，来自25 个无关家庭。 病例报道来自欧洲28 例、美国12 例和日本9 例。 XIAP 基因定位于染色体Xq25，全长约54 Kb，含 6 个外显子，编码497 个氨基酸。迄今，已发现能 导致发病的XIAP 基因突变25 种，包括位移突变 8 种、无义突变7 种、缺失突变5 种及错义突变5 种。 在XIAP 突变的HLH 患者中可以检测到不同程度 的XIAP 蛋白表达下降甚至缺失。

原发性HLH 包括家族性HLH（FHL）和其它 免疫缺陷相关的HLH。FHL 按照致病基因不同分 为五个亚型：FHL1（位于9q21.3-22 的未知基因）、 FHL2（PRF1）、FHL3（UNC13D）、FHL4（STX11） 及FHL5（STXBP2）。此外还有其它未知基因参 与了HLH 的发生。据Marsh 等^[11] 报道，XIAP 基 因突变患者有90% 发生HLH，且50% 的患者有阳 性家族史，认为该病应该定义为X 连锁的FHL 更 为准确，并建议在HLH 患者中筛选XIAP 基因突 变患者。过去通常认为EB 病毒感染是HLH 的触 发点，但XIAP 基因突变患者中却不一定发生EBV 感染，提示也许存在着其他不明抗原刺激能够诱 发XIAP 表现型的发生^[12]。

据报道，FHL 各亚型的发病率在不同民族之 间有不同。Molleran 等^[13] 报道在日本FHL3 发病 率几近等于或略高于FHL2。Zur 等^[14] 报道在德国 FHL2 与FHL3 发病率相等，在FHL 中约占25%。 有相当多的FHL2 病例报道来自非裔美国人、白 人、西班牙人以及亚洲人，但到目前为止在美国 人中尚未见FHL3 病例的报道。在土耳其人中， FHL 的主要亚型是FHL2，而STX11 基因突变所致 的FHL4 型也出现在该民族；与之相反的是，在非 土耳其人包括中国人中尚未发现FHL4 型^[14]。目 前尚无各民族HLH 病例XIAP 突变发生率的确切 数据统计，但推测其很可能与其它类型HLH 类似， 即该基因突变在原发性HLH 所占比例亦随民族不 同而各异。本研究对65 例中国HLH 患儿进行了 XIAP 基因突变检测，在外显子编码区未发现任何 致病突变，表明XIAP 基因突变可能仅限于特定的民族和地域。此外，也不排除部分由于非编码区 异常导致的蛋白表达下降，可待进一步蛋白水平 的研究，如流式细胞术检测XIAP 蛋白表达水平等。 FHL 年发病率约0.12/10 万，若未经治疗其 中位生存期仅2 个月。研究已经发现了影响该病 发生发展及预后的诸多因素，其中基因异常是重 要的因素之一^[15]。本研究在该组人群发现了1 个 位于编码区的SNP 位点rs5956583。此前曾有报 道该SNP 与特发性周期性发热易感性相关，423Q 携带者与高分泌的促炎因子TNF-α 有关^[16]。本 研究首次在中国儿童中进行XIAP 基因rs5956583 （42009A>C）分型，检测到AA、CC、AC 三种基 因型均在该人群中占有一定比例。但未发现各基 因型与儿童HLH 易感性的明显关系，提示其可能 并不参与儿童HLH 的发病过程。未来还需要更多 的对XIAP 其它多态性位点的研究，以期发现能够 揭示儿童HLH 易感性、治疗效果及预后有意义的 分子生物学标志。