苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU） 是由于 脏苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）活性减低或缺乏，导致苯丙氨酸（phenylatanine, Phe）代谢障碍的一种常染色体隐性遗传病， 其主要致病原因是苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因发 生突变^[1]。研究发现，我国PKU 患者PAH 基因外 显子7 突变检出率最高^[2]。宁夏位于我国西北地区， 人口以回族和汉族为主，其中回族约占1/3，PKU发病率为0.29‰（1/3 423）^[3]。本研究对临床确诊 的73 例经典型PKU 患儿PAH 基因外显子7 进行 突变检测分析，探讨宁夏地区PAH 基因突变的特 点，为该地区开展PKU 产前基因诊断提供依据。 1　资料与方法 1.1　研究对象

73 例（回族39 例，汉族34 例）经典型PKU 患儿均为宁夏新生儿疾病筛查中心于2010 年1 月 至2012 年12 月确诊，其中64 例为新生儿筛查确诊， 9 例为出现症状后确诊。年龄15 d 至13 岁，男性 38 例（回族17 例），女性35 例（回族22 例）。 初诊血Phe 浓度在582~2 940 μmol/L 之间（ 正常 参考值<120 μmol/L）。所有患儿均进行了尿喋呤 谱分析、血二氢蝶啶还原酶测定和四氢生物蝶呤 负荷实验，排除了四氢生物蝶呤缺乏症。另选取 100 名正常对照者（回族50 名，汉族50 名，均为 2012 年宁夏新生儿筛查标本），其血清Phe 浓度 <120 μmol/L，无PKU 家族史。本研究获得患儿家 长或监护人的书面知情同意。 1.2　研究方法 1.2.1　DNA 提取

　　应用血片卡快速酚/ 氯仿 抽提法，将带有血样的干滤纸卡片沿血滴4 周 剪下， 用1×TE500 μL+ NaCl（250 mmol/L） 800 μL 洗涤1 次， 加入200 μL 消化缓冲液 （100 mmol/L Tris pH 8.0，20 mmol/L ED-TA， 150 mmol/L NaCl，2% SDS），5 μL 蛋白酶K， 65℃水浴1 h。不去除纸片直接在消化液中加入 200 μL 饱和酚- 氯仿- 异戊醇（25 : 24 : 1）提取基 因组DNA。 1.2.2　PCR 扩增

　　PAH 基因外显子7 区域PCR 引物，严格按照引物序列设计原则设计完成^[4]，正 向引物序列：5'-ATGTCCCTGGGCAGTTATGTG-3'； 反向引物序列：5'-TGAGAACAGGAACAAGTGGCA- 3'，产物大小为512 bp。PCR 反应在ABI 9700 型扩增仪上进行（ABI 公司， 美国）， 总体积 20 μL， 其中含1.5 U Taq DNA 聚合酶（GeneAmp High Fidelity Enzyme， 美国ABI 公司）5 U/μL， 2 pmol/L 引物浓度，2.5 mmol/LM dNTP。循环条 件为95℃预变性15 min，先进行95℃变性45 s， 62℃退火或复性45 s（每个循环降0.5℃），72℃ 延伸60 s， 共循环11 次； 然后进行95 ℃ 变性 45 s，57℃退火或复性45 s，72℃延伸60 s，共24 个循环；最后72℃延伸7 min 后降温至4℃备用。 PCR 产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.3　序列测定

　　应用PCR 产物直接测序的方 法，样品纯化及序列分析由中国优生优育基因科 学专家指导中心应用ABI 3130 XL 型序列分析仪完 成（ABI 公司，美国）。 2　结果

2.1　突变类型 对73 例PKU 患儿共146 个PAH 等位基因外 显子7 及其旁侧内含子区域进行测序分析，结果 检测出6 种突变基因型，分别是R243Q、R241C、 IVS7+2T → A、L255S、G247V 和G247R（图 1）， 其等位基因频率分别为14.4%、6.9%、2.7%、0.7%、 0.7% 和0.7%，分为错义突变和剪接位点突变两种 （表1）。73 例患儿中4 例检测出2 个基因突变 （R243Q/R243Q 突变2 例， R243Q/R241C 突变1 例， IVS7+2T → A/G247R 突变1 例），30 例检测出1 个基因突变，外显子7 突变基因总频率为26.0% （38/146），其中回族为28.2％，汉族为23.5％ （χ²=1.09，P=0.297）。

图 1　73 例PKU 患儿的6 种PAH 突变基因型

表 1(Table 1)

表1　73 例PKU 患儿PAH 基因外显子7 突变结果

表 1　73 例PKU 患儿PAH 基因外显子7 突变结果

在检出的6 种PAH 突变基因中，突变频率最 高的是R243Q（14.4%），其中回、汉族儿童分别 为14.1％和14.7％（χ²=0.01，P=0.91）。突变频率 居第二位的是R241C（6.8%）。R241C 等位基因 突变的10 例患儿中，有8 例为回族儿童，回族患 儿检出率为10%，高于汉族儿童（3％），差异有 统计学意义（χ²=4.22，P=0.04）。IVS7+2T → A 突 变频率居第三位，G247V、G247R 和L255S 少见。 3　讨论

PKU 的病理基础是PAH 基因突变，正常PAH 基因由编码区的13 个外显子和非编码区的12 个 内含子组成，转录1 353 bp 的mRNA，翻译成含 451 个氨基酸的酶单体，PAH 每个亚基的改变都 会引起酶结构和功能的改变，当编码区及其两侧内含子有基因突变发生时，就会引起PAH 的功能 缺失或减低，导致相应的临床表现^[5]。PAH 基因 第7 外显子编码PAH 蛋白核心功能区,对保持该 酶活性起关键性作用^[6]，是基因分析的重点区域。 在13 个外显子中，我国最为常见的PAH 基因突变 区域发生于外显子7，以台湾地区为最高，达到了 42.0%^[7]，中国南方地区较低，为16.4%^[8]。本研究 中外显子7 及其旁侧内含子区域检出率为26.0%， 与河北、河南、内蒙古、山西接近^{[9, 10, 11, 12]}，但低于北 方地区^[2]、新疆地区^[13] 和天津地区^[14] 的相关报道。 因此在宁夏地区开展PAH 基因突变研究时应更多 关注外显子7 及其旁侧内含子区域。

本研究在宁夏地区PAH 基因外显子7 中共检 出了6 种突变类型，其中R243Q 等位基因频率最 高（14.4%），但与其他北方地区相比仍属较低频率。 现有报道显示，R243Q 主要存在于亚洲，多集中于 我国北方地区，而在河南的频率达到了20.5%^[10]。 处于第二位的R241C 以台湾地区最普遍（32.0%）^[7]， 日本（7.3%）^[15] 和韩国（6.0%）^[16] 也较为常见。 但在大陆，宁夏地区R241C 突变比率高于其他地 区。另外4 种突变IVS7+2T → A、L255S、G247R 和G247V 近几年在国内一些地区逐渐被报道， IVS7+2T → A 以山西、内蒙古多见^{[11, 12]}，L255S 河南、 新疆多见^{[10, 13]}，G247V 河南、天津多见^{[10, 14]}。值得 关注的是G247R 仅散在分布于我国京津冀及宁夏 地区^{[2, 8, 14]}，极为少见，似是我国北方地区特有的 一种突变基因类型（表2）。

表 2(Table 2)

表2　宁夏地区PAH 基因外显子7 突变型频率与其他地区比较　（％）

表 2　宁夏地区PAH 基因外显子7 突变型频率与其他地区比较　（％）