新生儿脑损伤是新生儿期最常见、最严重的 疾病之一，是导致新生儿死亡和儿童致残的常见 原因^[1]。随着新法复苏技术的普及以及产科分娩技 术水平的提高，新生儿窒息的发生率明显下降^[2]， 但新生儿脑损伤及其后遗症的发生率未见降低， 却有增加的趋势，其原因可能与近年来早产儿的 出生率大幅增加，而亚低温治疗等早期干预方案 仅适合于足月新生儿脑损伤，早产儿脑损伤目前 尚无公认有效的治疗措施有关^{[3, 4, 5]}。围生期感染是 导致早产及早产儿脑损伤的重要原因，其机制可 能与细胞因子、免疫反应、兴奋性氨基酸等介导 的神经细胞凋亡有关。近年来，随着对促红细胞 生成素（erythropoietin,EPO）功能的进一步探索和 认识，EPO 在脑损伤的保护作用方面也逐渐引起 人们关注，但其机制尚未完全明确。本研究采用 细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导法建立 新生鼠脑损伤模型^[6]，采用新生细胞标记物-5- 溴 脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）及细胞凋亡标志物—活 化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）， 探讨EPO 对新生大鼠感染性脑损伤后神经干细胞 发生区域—海马齿状回颗粒下层神经细胞增生与 凋亡的影响。 1　材料与方法 1.1　主要试剂

兔抗大鼠活化的Caspase-3 多克隆抗体和兔 抗大鼠BrdU 多克隆抗体及两步法免疫组化试剂盒 （SV002）均购于北京博奥森生物技术有限公司， DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司， 重组人EPO 及重组人EPO 空白对照品（仅含同等 分量的辅料成分）（cEPO）均由成都地奥集团提供。 1.2　实验动物及分组

26 只清洁级2 日龄（P2）Sprague-Dawley（SD） 新生大鼠[ 许可证号：SCXK（豫）2010-0002] 由 河南省实验动物中心提供，雌雄不限，体重6.9± 0.4 g。在光照- 黑暗各交替12 h 条件下，由母鼠 自由喂养，采用随机数字表法随机分成对照组（8 只，腹腔注射等容积的生理盐水+ 等容积的EPO 空白对照品）、LPS 组（9 只，0.6 mg/kg LPS+ 等 容积的EPO 空白对照品）及EPO 干预组（9 只， 0.6 mg/kg LPS+5 000 U/kg EPO）3 组， 各组均连 续注射5 d（即P2~P6）。通过连续腹腔注射5 d LPS（0.6 mg/kg）建立生后感染导致新生鼠脑损伤 模型^[6]。各组新生大鼠同时腹腔注射50 mg/kg 的 BrdU，每日1 次，连续注射5 d，并于最后1 次注 药后24 h（即P7）称重，灌注取脑，采用苏木素- 伊红（HE）染色法计数海马齿状回单位面积神经 细胞数，应用免疫组化法检测脑组织海马齿状回 颗粒下层BrdU 和活化Caspase-3 蛋白的表达情况。 1.3　标本制作

3 组新生大鼠于最后一次用药后24 h（P7）， 采用乙醚吸入麻醉，取仰卧位，剑突下呈V 字形 剪开皮肤，剪断两侧胸廓暴露心脏，右心耳处剪口， 将连有头皮针的注射器刺入心尖处；生理盐水灌 注，再用4% 多聚甲醛灌注至躯体变硬苍白，打开 颅腔快速剥取脑组织，浸泡固定于4% 多聚甲醛中 48 h，梯度酒精脱水和二甲苯透明，石蜡包埋。以 海马部位为标志，冠状位连续切片，每隔20 张留 取1 张，切片厚度为5 μm，烤片后备用。 1.4　BrdU 及活化Caspase-3 免疫组织化学法

石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化， 蒸馏水洗3 次后，枸橼酸钠微波加热修复8 min （中高火3 min + 低火5 min），冷却后蒸馏水洗 2 次，滴加3% 过氧化氢温育10 min，蒸馏水、 PBS 各冲洗2 遍，加封闭血清温育10 min，甩干 分别滴加一抗（兔抗大鼠BrdU 或兔抗大鼠活化的 Caspase-3，1 : 50），37℃ 温浴1 h，4 ℃ 过夜。其 中BrdU 染色时，在滴加封闭血清及一抗前，需使 DNA 变性，即加 2 M HCl，37℃ 30 min，滴加 0.1 M 硼酸盐缓冲液（pH 8.5），10 min，PBS 洗 3 次， 各5 min。PBS 冲洗后滴加生物素化二抗 37 ℃ 温 育30 min，PBS 洗 3 次，DAB 显色 2~3 min，苏木 素复染 6~8 s，盐酸酒精分化，自来水冲洗，脱水、 透明、中性树胶封片。PBS 代替一抗作阴性对照。 1.5　HE 染色

石蜡切片脱蜡，梯度酒精水化，滴加苏木精 液染色2 min；蒸馏水洗1 min，盐酸酒精分化， 蒸馏水洗2~3 s，滴加伊红溶液染色2 min；脱水、 透明、封片。 1.6　细胞计数

采用Biosens Digital Imaging Systems V1.6 分析 系统进行细胞计数。随机计数每张切片海马齿状 回部位5 个100 μm×100 μm 面积内神经细胞数并计算其均值，每一动物取5 张切片再取均值，作 为该动物海马齿状回单位面积内神经细胞数量 （ 个/mm2）。每一动物取5 张切片，计数每张 切片相同视野下海马齿状回颗粒下层BrdU 与活 化 Caspase-3 的阳性细胞数，取其均值作为该动物 BrdU 和活性Caspase-3 阳性细胞数，阳性细胞均表 现为细胞核呈深棕色染色。 1.7　统计学分析

采用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行统计学 分析，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示， 多组资料间比较采用单因素方差分析，组间两两 比较采用LSD 法。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组新生大鼠体重比较

各组新生大鼠在P2 时，体重差异无统计学意 义（P>0.05）；P7 时，各组新生大鼠体重差异明显， EPO 干预组和LPS 组均低于对照组，差异有统计 学意义（P<0.05）；但EPO 干预组与LPS 组比较 差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表 1(Table 1)

表1　各组新生大鼠不同日龄体重变化的比较　（x±s，g）

表 1各组新生大鼠不同日龄体重变化的比较　（x±s，g）

HE 染色显示对照组海马齿状回细胞排列整 齐、层次清晰；LPS 组细胞界限不清、层次紊乱， 细胞数目减少；EPO 干预组较LPS 感染组细胞层 次清晰。EPO 干预组、LPS 组脑组织海马齿状回 单位面积内神经细胞数均低于对照组，差异有统 计学意义（P<0.05），但EPO 干预组与LPS 组比 较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表 2(Table 2)

表2　各组脑组织BrdU、活化Caspase-3 阳性细胞及神 经细胞数的比较　（x±s）

表 2 各组脑组织BrdU、活化Caspase-3 阳性细胞及神 经细胞数的比较　（x±s）

海马齿状回颗粒下层BrdU 阳性细胞和活化 Caspase-3 阳性细胞表现为细胞核呈深棕色染色。 各组新生大鼠脑组织中均可见BrdU 阳性细胞，其 数量3 组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。 EPO 干预组BrdU 阳性细胞数较LPS 组增多，但仍 较对照组减少（P<0.05）。各组新生大鼠脑组织均 可见活化Caspase-3 阳性细胞，EPO 干预组活化的 Caspase-3 阳性细胞数较LPS 组减少，但仍多于对 照组（P<0.05）。见图 1、表2。

图 1 各组新生大鼠海马齿状回颗粒下层BrdU 及活化Caspase-3 的阳性表达（×400）　　E PO 干预组大鼠 大脑海马齿状回颗粒下层BrdU 表达较LPS 组明显增多，但较对照组减少，BrdU 阳性细胞胞核呈棕褐色（黑色箭头所示）。 EPO 干预组大鼠大脑海马齿状回颗粒下层活化Caspase-3 的表达较LPS 组减少，但仍多于对照组，活化Caspase-3 阳性细胞表 现为胞核呈深棕色（红色箭头所示）。

围生期感染是导致早产及早产儿脑损伤的重 要原因，感染所致早产儿脑损伤防治的研究越来 越引起人们的关注。早产儿脑损伤与中枢神经系 统对疾病的易感性、感染诱发的固有免疫应答、 全身性暴露于细菌感染而引起的脑组织炎症反应 有关^[7]。目前，LPS 致脑损伤法是新生鼠生后感染 性脑损伤的常用动物模型^{[8, 9]}，简单易行，故本研 究采用2 日龄新生鼠连续5 d 腹腔注射0.6 mg/kg LPS 制成生后感染性脑损伤的动物模型^[6]，探讨 EPO 对感染性新生大鼠脑损伤的保护作用及其相 关机制。

EPO 是一种多功能细胞因子，除具有促进未 成熟前体红细胞增生作用外，近年来研究发现脑 组织内可见EPO 表达，且其与神经干细胞的增生、 分化以及存活有关^[10]。在损伤和应激因素作用下， 脑组织内源性EPO 短暂性表达增加作为神经营养 因子减轻脑损伤程度或作为免疫调节因子及干细 胞增生刺激因子促进脑组织的结构与功能重建^[11]。 由于损伤后脑组织结构与功能的重建是一个慢性 过程，脑组织内需维持较高EPO 水平以促进脑功 能恢复；然而，外源性EPO 是大分子物质，能否 通过血脑屏障成为关注焦点。动物实验及人体试 验证实外源性EPO 能透过血脑屏障进入脑组织， 对脑损伤有保护作用，显示出较好的应用前景^{[12, 13]}。 外源性EPO 干预可起到神经保护作用，这已在许 多研究中证实。Kumral 等^[14] 采用新生大鼠缺氧缺 血性脑损伤（HIBD）模型发现模型制备成功后即 刻腹腔注射小剂量EPO 可以减少脑损伤的体积， 减少神经细胞凋亡数目，说明EPO 对HIBD 有保 护作用，其机制之一可能为减少神经细胞凋亡。 Shen 等^[15] 通过建立孕鼠宫内感染模型发现，新生 大鼠生后立即给予3 000~5 000 IU/kg 的EPO 对感 染所致少突胶质细胞损伤、反应性星形胶质化以 及轴突损伤有保护作用，可减轻神经纤维的损伤。 Mizuno 等^[16] 采用3 日龄新生鼠脑室周围白质软化 （PVL）模型发现，在缺氧缺血（HI）前15 min 给予小剂量rhEPO 能有效保护HI 后脑损伤。上述 研究^{[14, 15, 16]} 均表明EPO 对脑损伤有保护作用。故本 研究主要探讨EPO 对感染性新生大鼠脑损伤后神 经细胞增生与凋亡的影响，为EPO 治疗感染性脑 损伤提供理论依据。

BrdU 是DNA 前体胸腺嘧啶核苷类似物，对 处于S 期细胞通过竞争方式掺入DNA 单链，通过 免疫组化及免疫荧光技术可观察S 期细胞分布，故 可用来鉴定新生细胞及其增殖情况^[17]。在中枢神 经系统内，神经干细胞能不断分裂出新生神经细 胞，而海马齿状回颗粒下层，则是脑组织中主要 的神经细胞增生区域之一，且终身保持生成新生 神经细胞能力。本研究发现， EPO 干预组海马齿 状回颗粒下层BrdU 的表达少于对照组，但较LPS 组明显增多，提示EPO 可促进感染性脑损伤新生 大鼠海马区新生神经细胞的增生。活化Caspase-3 是程序性细胞死亡的关键执行者，且在调控病理 性细胞凋亡中起关键作用，是细胞凋亡的典型标 志物。本研究发现EPO 干预组活化Caspase-3 的表 达较LPS 组减少，但仍高于对照组，提示EPO 可 减少感染性脑损伤新生大鼠海马神经细胞的凋亡。 本研究发现EPO 干预组与LPS 组P2、P7 时体重 差异无统计学意义，提示EPO 对体格生长发育无 明显影响。感染后海马齿状回神经细胞数较对照 组减少，EPO 干预后并未发现能明显增加海马齿 状回总神经细胞数量，其原因可能与本研究仅采 用HE 染色，而未对神经细胞进行特殊染色，不易 针对海马齿状回分子层、颗粒层、多形细胞层等 进行分层计数有关。此外，我们仅研究了海马齿 状回颗粒下层的细胞增生情况，并未探讨其分化情况，这些新生细胞是进一步分化为神经元还是 神经胶质细胞，尚需进一步探讨。

总之，EPO 可减轻感染性脑损伤新生大鼠海 马齿状回神经细胞的凋亡、促进神经细胞的增生， 可能为EPO 对感染脑损伤的神经保护作用机制之 一。