新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是指各种围生期窒息引起的 部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿 或新生儿脑损伤^[1]。HIBD 的发病原因涉及到能量 代谢障碍、氧自由基损伤、钙超载、兴奋性氨基 酸及其受体毒性等各个方面^[2]。在哺乳动物的中枢 神经系统中，特别是未成熟脑中，组织的修复和 代偿机制会影响其远期的损伤情况和功能恢复情 况，因此近期的病理或行为评估不一定和远期评 估的结果一致^[3]。

焦虑行为是目前越来越受到医学界重视的异 常行为，而其发生与脑功能受损相关。众所周知， 围产期缺氧缺血是导致儿童脑损伤的常见病因之 一，临床回顾性研究报道结果显示，与正常儿童 相比，有围产期窒息和HIBD 病史的患儿青春期和 成年后焦虑症发病率较高^[4]；同时有研究应用新生 大鼠HIBD 模型发现初生时缺氧缺血损伤可导致大 鼠青春期焦虑行为发生改变^{[5, 6]}。焦虑作为一种情 绪反应，包括本能和所伴随的自主神经反应，二 者与下丘脑边缘系统的活动均有密切的关系。有 研究发现下丘脑部位和杏仁核的fos 磷蛋白在焦虑 机制中起重要作用^[7]。同时有研究证实胰岛素样生 长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）具有 促进c-fos 基因表达作用^[8]，且同一细胞中IGF-1 受体mRNA 的表达与c-fos 免疫活性的表达是相伴 而行的^[9]。动物实验证实，大鼠大脑中动脉（MCA） 闭塞再灌注后经侧脑室给予IGF-1，可显著减轻脑 缺血损伤区的神经元缺失^[10]。外源性给予IGF-1 可减轻新生鼠HIBD，且该神经保护作用可能与 IGF-1 通过AktGSK3beta 途径减轻神经细胞凋亡有 关^[11]。那么，外源性给予IGF-1 是否对HIBD 后的 焦虑行为产生影响，目前未见有关文献报道。酪 氨酸羟化酶（tyroxine hydroxylase,TH）是合成多巴 胺的限速酶以及标记多巴胺神经元的常用指标， 而研究发现多巴胺神经递质功能的改变可导致焦 虑行为异常^{[12, 13]}。本研究的目的是应用新生大鼠 HIBD 模型，观察HIBD 大鼠远期焦虑行为及TH 表达的变化，并通过IGF-1 的干预来探讨IGF-1 对 HIBD 大鼠远期焦虑行为和TH 表达的影响以及相 关可能机制。 1　材料与方法 1.1　动物分组和HIBD 模型制作

健康新生7 日龄（P7）清洁级Sprague-Dawley （SD）大鼠90 只，雌雄不限，体重10~16 g，由 中南大学湘雅动物实验部提供。随机分为正常对 照组、HIBD 组和HIBD+IGF-1 组，每组各30 只。 按Rice 法制作新生大鼠HIBD 模型（即左颈总动 脉分离结扎后，再暴露于8% 氧气和92% 氮气的 低氧环境中2 h）。HIBD+IGF-1 组于缺氧缺血后 即刻腹腔注射IGF-1（产品编号：4119-100，产品 批号Lot：B2029，美国BioVision 公司生产），剂 量为0.2 mg/kg，其余两组腹腔注射等量的生理盐 水。 1.2　高架十字迷宫实验

高架十字迷宫为测试动物焦虑行为的经典实 验。高架十字迷宫由中南大学湘雅二医院精神心 理卫生研究所提供，包括两条50 cm×10 cm×1 cm 相对开放臂和两条50 cm×10 cm×40 cm 相对闭 合臂，中央由10 cm×10 cm 的区域连接，距离地 面50 cm。各组于HIBD 后14 d 和21 d（即P21 和 P28）进行高架十字迷宫实验，每组各时间点取10 只大鼠。大鼠从中央区面向闭合臂放入迷宫，观 察记录5 min 内大鼠的活动情况，主要记录开放 臂停留时间（进入开放臂停留的时间）、开放臂 停留时间比率[ 开放臂停留时间/（开放臂停留时 间+ 闭合臂停留时间）×100%]、开放臂进入次数（进入到任一开放臂的次数，以小鼠4 个爪子均 进入到臂内为准，中途1 爪子从该臂中完全退出 则为该进入活动完成）和开放臂进入次数比率[ 开 放臂进入次数/（开放臂进入次数+ 闭合臂进入次 数）×100%]。 1.3　免疫组织化学方法测定中脑黑质TH 的表达

实验动物于缺氧缺血后7、14、21 d（ 即 P14、P21、P28）经麻醉、心脏灌注、固定、断头 取脑，再次固定、脱水、包埋，于海马黑质水平 制作10 μm 厚的脑组织冠状切片进行免疫组化染 色，DAB 显色，每组各时间点取8 只大鼠，每只 大鼠取4 张切片，每张切片随机取4 个视野。一 抗为小鼠抗大鼠脑黑质 TH 单克隆抗体（1 : 100， chemicon 公司），二抗为马抗小鼠的IgG 单克隆 抗体（1 : 400，Vector 公司）。在日本产Nikon Eclipse 80i 显微镜下观察结果，并用Nikon DS 高 分辨率数码像机经NIS-Elements AR3.0 软件拍照， 收集脑组织切片中黑质及海马切面图像。采用 Ver.3.00 程序软件作图像数字采集及半定量分析 （以着色面积占组织切片总面积的比例确定为标 志物免疫组化的阳性数值）。 1.4　统计学分析

采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分 析。在符合正态分布前提下，计量资料以均数± 标准差（x±s）表示；在方差齐性的前提下，多 组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用 Kruskal-Wills H 检验，组间两两比较采用SNK-q 检 验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　高架十字迷宫测试结果 2.1.1　开放臂停留时间

　　开放臂停留时间越短，表明动物的焦虑情绪越严重。本实验结果显示P21 和P28 两个时间点HIBD 组和HIBD+IGF-1 组动物 的开放臂停留时间均较正常对照组明显减少（均 P<0.05）；尽管HIBD+IGF-1 组的开放臂停留时间 较HIBD 组有所延长，但两组之间的差异无统计学 意义（P>0.05）。见表1。

表 1(Table 1)

表1　高架十字迷宫实验结果　（x±s，n=10）

表 1高架十字迷宫实验结果　（x±s，n=10）

　　开放臂停留时 间比率越小，表明动物的焦虑情绪越严重。本 实验结果显示P21 和P28 两个时间点HIBD 组 和HIBD+IGF-1 组动物的开放臂停留时间比率 均较正常对照组明显减少（均P<0.05）； 尽管 HIBD+IGF-1 组的开放臂停留时间比率较HIBD 组有所上升，但两组之间的差异无统计学意义 （P>0.05）。见表1。 2.1.3　开放臂进入次数比率

　　进入开放臂的次 数减少，表明动物活动性降低。本实验研究结果 显示P21 和P28 两个时间点，正常组、HIBD 组和 HIBD+IGF-1 组大鼠开放臂进入次数比率差异无统 计学意义（P>0.05），见表1。 2.2　免疫组化染色检测各组黑质TH 表达

各组TH 阳性反应物质（棕色）主要分布在 细胞质中，各组阳性细胞的细胞膜基本完整，细 胞形态无明显异常，从细胞形态判断该阳性细胞 为神经元，见图 1。

图 1 　P28 时各组黑质TH 免疫组化染色结果（DAB 显色，×400）　　 各组TH 阳性反应物质（棕色）主要分布 在细胞质中，各组阳性细胞的细胞膜基本完整，细胞形态无明显异常，从细胞形态判断该阳性细胞为神经元。

HIBD 后各时间点，HIBD 组TH 的阳性表 达细胞数较正常对照组和HIBD+IGF-1 组减少， 提示HIBD 组TH 阳性表达水平下降（图 2）。 与正常对照组相比，P21 和P28 时HIBD 组和 HIBD+IGF-1 组的TH 免疫染色阳性面积百分比明 显降低（P<0.05），但HIBD 组与HIBD+IGF-1 组 之间差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

图 2 各组黑质TH 免疫组化染色结果（DAB 显色，×100）　　 正常对照组各时间点黑质部位均密布TH 阳性染色 细胞（棕色），HIBD 组的TH 阳性染色细胞数量较对照组明显减少；HIBD+IGF-1 组的TH 阳性染色细胞数量较对照组减少， 但较HIBD 组稍有增加。

表 2(Table 2)

表2　各组各时间点TH 免疫染色阳性面积百分比 （x±s，n=8）

表 2各组各时间点TH 免疫染色阳性面积百分比 （x±s，n=8）

在儿童生长发育过程中，青春期的心理焦虑 程度处于相对较高的水平。焦虑症是一种并非由 焦虑刺激引起的或不能用焦虑刺激合理解释的， 以焦虑情绪体验为主，可表现为长期或过度的担 忧及紧张、对没有危害或危害甚小的对象的恐惧 等，同时伴有植物神经系统功能紊乱的神经症。 目前焦虑症是儿童期患病率最高的心理障碍之一， 且患病率有逐年增高的趋势。焦虑症的发生与脑 功能受损相关，但目前并无证据证明导致焦虑的 脑功能受损最可能发生在什么时间，而围产期缺 氧缺血导致的脑损伤是常见的导致儿童脑损伤的 病因之一，那么围产期的HIBD 与焦虑症的发病之 间是否存在关联是本课题关注的切入点。本研究 应用HIBD 动物模型，了解了HIBD 恢复期后、当 实验动物处于青春期阶段的焦虑样行为改变，同 时应用IGF-1 在围产期进行干预、了解IGF-1 对该 焦虑行为改变的影响。

SD 大鼠的自然寿命为2.5~3 年，P28 时断奶 并具有交配生殖能力，因此P14~P28 被认为是SD 大鼠的青春期。在研究焦虑行为问题的动物实验 中，高架十字迷宫为非条件反射模型，是测试动 物焦虑水平的经典测量方法，是利用动物对新异 环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理，形 成动物的矛盾行为，来反映动物的焦虑情绪，以 进入开放臂次数和在开放臂停留时间的长短来反 映动物的焦虑状态，在焦虑动物中上述两指标明 显降低。大鼠进入开放臂的次数代表其活动性， 如果大鼠进入开放臂的次数无减少，表明其活动 性无改变。本研究结果显示，就开放臂的进入次数 比率而言，HIBD 组与正常对照组和HIBD+IGF-1 组之间比较差异无统计学意义，表明动物的活动 性无改变。而就开放臂的停留时间及开放臂停留 时间比率而言，HIBD 组和HIBD+IGF-1 组均较正 常对照组明显降低，提示HIBD 后，大鼠青春期的 焦虑程度升高，IGF-1 干预后开放臂的停留时间及 开放臂停留时间比率均较未干预组有所升高，尽 管升高程度无统计学差异，但仍提示IGF-1 可能对 焦虑样行为起到一定程度的抑制作用。该结果与 Fan 等^[14] 报道的HIBD 可减轻早产大鼠远期焦虑 行为的结果不相符合，该研究是应用4 日龄早产 大鼠双侧颈总动脉结扎造成HIBD，于P20 时采用 高架十字臂测定动物的焦虑行为，结果显示缺氧 缺血造成了动物青春期的焦虑样行为减轻。临床 回顾性研究报道结果显示有围产期窒息和HIBD 病 史的患儿青春期和成年后焦虑症发病率比正常儿 童高^[4]，与本次研究结果相同。但由于本研究结果 显示IGF-1 干预后的HIBD 大鼠在P21 和P28 两个 时间点的焦虑程度与HIBD 组比较无统计学差异， 因此目前本研究只能得出以下结论：IGF-1 干预后， 动物的高架十字迷宫各项焦虑指标均未得到改善， 提示其焦虑样行为的异常改变与IGF-1 及其受体可 能无关联，IGF-1 不能对HIBD 造成的焦虑行为产 生保护作用。

众所周知，多巴胺是儿茶酚胺神经递质中的 一种，TH 是多巴胺合成过程的限速因子，TH 的 表达情况反应了多巴胺能神经元的生存情况，因 而在对多巴胺的研究中将TH 作为多巴胺能神经 元的特征。在帕金森病动物模型免疫组化实验研 究中，TH 是用以标记多巴胺神经元最常用的指 标^[15]。多巴胺神经递质功能降低可导致5- 羟色胺 （5-hydroxytryptamine,5-HT）功能相对增强，而5-HT 功能增强可导致焦虑。本实验发现在HIBD 后7 d （P14 时间点），大鼠大脑黑质部位的TH 表达未 减少，考虑可能与时间太早导致变化不明显及实 验动物例数较少有关，而在HIBD 后14 d 及21 d （P21、P28），大鼠大脑黑质部位的TH 表达均减 少，与Tatton 等^[16] 在老年小鼠缺血性脑损伤模型 中观察的焦虑样行为、多巴胺及其代谢产物的改 变的结果一致，提示HIBD 与单纯缺血均可累及到 处于快速生长发育期动物的多巴胺系统，使多巴 胺神经元受损，可能是多巴胺功能降低使5-HT 功 能相对增强而导致焦虑。

IGF-1 在脑中有广泛的分布，其是由78 个氨 基酸组成的单链多肽，是一种肽能生长因子，具有非选择性神经营养作用，存在于脑组织中，参 与脑的生长发育^[17]。有研究报道IGF-1 在HIBD 中 具有减轻细胞凋亡的作用^[18]。本实验研究结果显 示HIBD 后即刻给予IGF-1（0.2 mg/kg）腹腔注射， HIBD+IGF-1 组黑质TH 的表达与HIBD 组相比较 差异无统计学意义，提示IGF-1 可能不能改善多巴 胺能神经元功能，不能通过使黑质部位TH 的表达 增多而影响5-HT 水平。

人作为生命活动连续的个体，许多儿童期的 疾病（包括新生儿期某些疾病）与成年之后的疾 病之间存在必然的联系。但是，由于新生儿学科 与身心医学科分别属于两个完全不同的专科，相 互对各自的临床诊治重点和医学基础研究都缺乏 足够的了解；而新生儿科与儿童保健专科尽管都 隶属于儿科范畴，但由于临床诊治对象差异较大， 因此两个亚专科之间的合作也较少。本研究的创 新点是：应用HIBD 动物模型，将属于新生儿专科 的HIBD 与属于身心医学科的焦虑症联系起来，发 现围产期HIBD 可使大鼠青春期焦虑行为发生改 变，其机制与脑黑质TH 表达的减少相关，但初生 时给予IGF-1 干预对大鼠HIBD 远期焦虑行为的异 常不产生作用，且IGF-1 不影响脑黑质TH 的表达， SD 大鼠青春期焦虑样行为的改变可能不受IGF-1 调控。