哮喘是由包括呼吸道炎性细胞、结构细胞等 多种细胞和细胞组分共同参与的慢性呼吸道炎症 性疾病。以气道高反应性、慢性气道炎症、气道重 塑为主要病理特征，其发病机制复杂，目前尚未明 确。近年来儿童哮喘的发病率及病死率逐年提高， 严重影响儿童的健康及生活质量。高迁移率族蛋 白B1（high mobility group box 1,HMGB1）是一种高 度保守的普遍存在的核蛋白，主要由巨噬细胞、单 核细胞、垂体细胞等在炎症因子刺激下主动释放， 也可由坏死细胞主动释放。HMGB1 作为一种免疫 调节因子，当其释放出细胞外会激发免疫系统产 生炎症反应，免疫细胞受到HMGB1 的刺激后同样 会产生特定的应激反应^[1]。HMGB1 作为一种晚期 炎症因子，即参与多种细胞因子、血管黏附分子 促炎细胞趋化等相互作用引起的炎症反应又参与 信号转导过程^[2]。在信号转导的机制中研究证实： HMGB1可与其受体Toll样受体4（toll like receptors 4, TLR4）相互作用，通过激活NF-κB，引起下游炎 症介质释放。1,25-(OH)2D3 是维生素D3 的活性形式， 除有调节钙、磷代谢作用，还具有调节免疫作用， 主要通过活化的单核细胞及树突状细胞（dendritic cell,DC）来影响免疫状态^{[3, 4]}，影响多种细胞的生 长和分化。目前其对哮喘中的作用尚不明确，本研 究通过建立小鼠哮喘模型，并用1,25-(OH)2D3 干预, 观察其对小鼠气道重塑及HMGB1 和TLR4 表达的 影响，以探求哮喘的发病机制，并为哮喘的治疗寻 求新的靶点。 1　材料与方法 1.1　动物及主要试剂

30 只 SPF 级BALB/c 雌性小鼠，6 周龄，体 重20±2 g，购于河南省实验动物中心[ 许可证号： SCXK（ 豫）2010-0002]，1,25-(OH)2D3 和鸡卵清 蛋白（ovalbumin,OVA）购于Sigma 公司，免疫组 化一抗购于北京博奥森生物技术有限公司，二抗 及显色剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司， TRIzol、反转录试剂盒和PCR 试剂购于北京全式 金生物技术有限公司。 1.2　动物分组和哮喘小鼠模型的制备

将30 只BALB/c 小鼠随机分为对照组、哮喘 组和1,25-(OH)2D3 干预组，每组10 只。适应性饲 养1 周后，参照文献^[5] 制备动物模型：在第 1、 8、15 天哮喘组和干预组小鼠分别腹腔内注射抗原 混合液0.2 mL（ 含10% 氢氧化铝0.15 mL、OVA 50 μg 和生理盐水 0.05 mL） 致敏， 对照组给予 0.2 mL 生理盐水腹腔注射；第22 天开始，哮喘组 和干预组小鼠雾化吸入1% OVA 激发，每日1 次， 每次30 min，持续至第35 天，共计14 次；干预 组在每次激发前0.5 h 给予腹腔内注射1,25-(OH)2D3 混合液0.08 mL[ 含1,25-(OH)2D3 0.08 μg、无水乙 醇2.0 μL、生理盐水0.08 mL]，哮喘组每次激发前 0.5 h 给予腹腔注射生理盐水0.08 mL；对照组激发 前0.5 h 腹腔注射和雾化激发均用生理盐水替代。 1.3　肺组织标本制备

各组小鼠于末次雾化激发结束后24 h 内以乙 醚吸入麻醉，开胸、结扎左肺门、取出左肺，冻 存于液氮中，用于RT-PCR 检测。经右心室插管至 肺动脉，用生理盐水快速冲洗至无血液流出，肺 叶颜色呈白色后，换4% 甲醛溶液冲洗，进行内固 定，取出右肺，置于4% 甲醛溶液中行外固定48 h， 酒精梯度脱水，石蜡包埋，采用连续切片，4 μm 厚度切片，每隔3 张切片选取1 张，用于苏木精－ 伊红（HE）染色及免疫组织化学染色。 1.4　HE 及免疫组化染色

随机选取每只小鼠肺组织3 张石蜡切片，脱 蜡后行HE 染色，观察支气管壁的形态学改变，每 张切片随机选取5 个以上高倍镜视野，采用 Image Pro Plus 6. 0 图像分析软件测定相同级别支气管横 断面气道壁厚度变化。另随机选取每只小鼠肺组 织3 张石蜡切片，脱蜡后依次滴加山羊抗小鼠一 抗、二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素， DBA 显色、苏木素复染、盐酸分化、脱水封片， 然后进行免疫组化操作，观察阳性细胞中HMGB1 和TLR4 蛋白的表达，每张切片随机选取5 个以上 高倍镜视野，应用计算机病理图像分析系统测定 平均IOD 值作为该片的蛋白半定量结果。 1.5　RT-PCR 检测HMGB1 及TLR4 mRNA 表达

采用TRIzol 提取左肺组织总RNA，使用逆转 录试剂盒合成单链cDNA，再设计引物，扩增目的 基因HMGB1 上游引物为：5'-CGGATGCTTCTGTCAACT- 3'，下游引物为：5'-TCAGCTTGGCAGCTTTCT- 3'，产物大小为360 bp；目的基因TLR4 上游 引物为：5'-GGTGAGAAATGAGCTGGTA-3'， 下游引物为：5'-TCTGCTAAGAAGGCGATA-3'， 产物 大小为313 bp；内参GAPDH 上游引物为：5'-CCACTTGAAGGGTGGAGC- 3'，下游引物为：5'-TGAAGTCGCAGGAGACAA- 3'， 产物大小为 530 bp。反应 体系为50 μL， 其中cDNA 2 μL、上下游引物各 1 μL、缓冲液（含Mg2+） 5 μL、dNTPs 4 μL、DNA 聚合酶1 μL、ddH2O 36 μL。反应条件：94℃预变 性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延 伸1 min，共 35 个循环；72℃延伸10 min。扩增 产物在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳，并采用凝胶 电泳成像系统观察目的基因，目的基因HMGB1 或 TLR4 mRNA 的表达量以HMGB1 或TLR4 的DNA 条带与内参GAPDH 的DNA 条带灰度值的比值表 示。 1.6　统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示，多 个样本均数的比较采用单因素方差分析，组间数 据两两比较采用 LSD-t 法，两变量的相关分析采用 Pearson 相关分析，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　小鼠肺组织病理形态学观察

对照组小鼠支气管壁结构完整光滑，上皮细 胞排列整齐，气道壁厚度适中（46±4 μm），少 量炎症细胞浸润；哮喘组小鼠支气管壁受损，上 皮细胞排列紊乱、脱落，气道壁增厚（134±7 μm）， 管腔狭窄，支气管周围较多炎性细胞浸润；干预 组气道壁厚度（84±5 μm）及炎症细胞浸润数量 较哮喘组减少，细胞排列程度较哮喘组规则（图 1）。 3 组气道壁厚度比较差异有统计学意义（P<0.05）， 见表1。

图 1 各组小鼠肺组织病理形态学改变　　 （苏木精- 伊红染色，×400） 对照组气道壁厚度适中，无管腔狭窄，上 皮细胞排列规则，少量炎症细胞浸润；哮喘组气道壁厚度较对照组明显增加，管腔狭窄，上皮细胞排列紊乱、脱落，炎症细 胞浸润增多；与哮喘组相比，干预组气道壁厚度明显减小，细胞排列更为规则，炎症细胞大量减少。。

表 1(Table 1)

表1　各组小鼠气道壁厚度、肺组织HMGB1 和TLR4 mRNA 及蛋白的表达变化　（n=10，x±s）

表 1各组小鼠气道壁厚度、肺组织HMGB1 和TLR4 mRNA 及蛋白的表达变化　（n=10，x±s）

HMGB1 和TLR4 蛋白均主要定位于炎症细胞 及上皮细胞的细胞核、胞浆。对照组小鼠HMGB1 及TLR4 蛋白表达较弱；哮喘组小鼠HMGB1 及 TLR4 蛋白呈强阳性表达，与对照组相比差异均有 统计学意义（均P<0.05）；干预组小鼠HMGB1 及 TLR4 蛋白的表达明显低于哮喘组，但仍高于对照 组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图 2、 表1。

图 2 各组小鼠HMGB1 和TLR4 在肺组织中的表达 （DAB 显色，×400）　　对照组HMGB1 和TLR4 表达较 弱，而在哮喘组两者均呈强阳性表达；干预组HMGB1 和TLR4 表达较哮喘组降低，但仍高于对照组。深棕黄色为HMGB1 或 TLR4 表达阳性细胞。

RT-PCR 检测结果显示， 哮喘组小鼠肺内 HMGB1 和TLR4 mRNA 相对表达量均较对照组显 著增高（均P<0.05） ；干预组小鼠肺内HMGB1 和TLR4 mRNA 相对表达量较哮喘组明显降低， 但仍高于对照组， 差异均有统计学意义（ 均 P<0.05）。见图 3~4、表1。

图 3 　各组小鼠HMGB1 mRNA 在肺组织中的表达　 M：DNA marker；1：对照组；2：哮喘组；3：干预组。

图 4 各组小鼠TLR4 mRNA 在肺组织中的表达　　 M：DNA marker；1：对照组；2：哮喘组；3：干预组。

肺组织内HMGB1 蛋白与TLR4 蛋白的表达 呈正相关（r=0.742，P<0.01），HMGB1 mRNA 与TLR4 mRNA 的表达亦呈正相关（r=0.940， P<0.01）。 3　讨论

HMGB1 在外源性微生物侵入或内源性组织损 伤发生时，可以作为应激信号和炎性介质通过两 种方式释放到胞外，一种是由活化的巨噬细胞和 DC 等免疫细胞主动分泌到胞外，另一种由多种病 理过程中组织细胞的坏死、损伤使核内的HMGB1 释放至细胞外。HMGB1 的主要生物学功能包括： （1） 作为促炎细胞因子，HMGB1 可以促进炎 性细胞活化以及刺激促炎因子的产生和分泌，如 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 表达，这些介质又能够 加强HMGB1 的分泌效应，形成一个复杂的细胞因 子分泌调节网络^[6]。（2）HMGB1 能诱导DC 成熟 并分泌多种促炎细胞因子，促进DC 表面共刺激分 子CD80、CD83、CD86 和MHC Ⅱ表达上调^{[7, 8]}。 （3）HMGB1 信号通过RAGE、TLR2 和TLR4 激 活一些与NF-κB 和丝裂霉素激活蛋白激酶P38 有 关的途径。

TLRs 是一类模式识别受体，TLRs 在免疫调节、 炎症反应方面具有重要作用，在固有免疫与适应 性免疫间起桥梁作用^{[9, 10]}。TLR4 是被发现的第一 个哺乳动物TLR，该蛋白在不同细胞中表达，如 气道上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨 噬细胞、骨骼肌细胞^[11]。HMGB1 在细胞坏死或某 些炎症因子刺激下，被动或主动地释放至细胞外 液，演变为重要促炎细胞因子，并作为危险相关 的分子模式与TLR4 等结合，启动相关信号途径而 激活NF-κB 诱导炎症因子的表达，促进细胞增殖 并增强细胞抗凋亡作用，HMGB1 还影响DC 的成 熟及迁移。目前有关HMGB1 和TLR4 在哮喘方面 的研究较少，本研究结果显示：哮喘组小鼠支气 管气道上皮细胞、单核巨噬细胞、B 细胞、T 细胞 及DC 的HMGB1 及TLR4 的表达量显著增多，由 此推断，HMGB1-TLR4-NF-κB 信号通路可能参与 哮喘气道炎症及气道重塑过程。

1,25-(OH)2D3 通过与细胞内的维生素D 受体 （VDR）结合发挥生物学效应，除了维持机体钙、 磷平衡，它还具有免疫调节作用。VDR 广泛分布 于全身各处^[12]，VDR 几乎表达于所有免疫细胞， 包括活化的CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、中 性粒细胞和抗原递呈细胞（如巨噬细胞和DC）^[13]。 维生素D3 与固有和适应性免疫应答均有密切关 系^[14]。据报道，由于日照不足或维生素D3 摄取不 够导致维生素 D3 缺乏可引起多种自身免疫病的发 病，如：1 型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑 狼疮、类风湿性关节炎和炎症性肠病等^[15]。动物 实验证明：向小鼠体内注入1,25-(OH)2D3 的类似物 骨化三醇可抑制DC 的成熟与活性，使DC 低表达 其成熟标记CD86、CD40 等共刺激分子和 MHC- Ⅱ 类分子，从而影响Th1/Th2 细胞的增殖^[16]。本次 实验研究结果显示：1,25-(OH)2D3 干预不仅能有效 减少哮喘炎症细胞浸润，还可降低气道壁厚度， 从而减轻哮喘小鼠的气道重塑。提示1,25-(OH)2D3干预治疗能有效减轻哮喘气道炎症，改善气道重 塑。RT-PCR 及免疫组化结果显示：干预组小鼠 肺组织HMGB1 和TLR4 mRNA 及蛋白水平均明显 低于哮喘组。提示1,25-(OH)2D3 可能是通过阻断 HMGB1-TLR4-NF-κB 信号传导通路来抑制下游炎 症因子的释放，从而减轻哮喘小鼠气道炎症及气 道重塑。

本次实验研究表明1,25-(OH)2D3 能有效减轻气 道炎症细胞的浸润及气道重塑，其作用于HMGB1- TLR4-NF-κB 通路的具体作用机制，有待于进一步 研究，以为哮喘的治疗提供新的靶点和途经。