原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome,PNS）是儿童时期常见的肾小球疾病。 肾脏病遗传学研究表明20多个不同的单基因突变 可导致常染色体隐性遗传型激素耐药型肾病综合 征（steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS）， 如NPHS1、NPHS2、WT1、MYO1E基因等 ^{[1, 2, 3, 4, 5]}。 SRNS的病理表现为局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）。30%~40%的 SRNS患儿在10年内进展至终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD） ^{[1, 6, 7]} 。迄今，国外研究者 在3个FGSG家系发现了MYO1E基因纯合突变， 呈常染色体隐性遗传方式 ^{[4, 5]} 。MYO1E基因定位于 人染色体15q21-22，有28个外显子；其编码蛋白 myosin 1e含有1108个氨基酸，参与胞吞、细胞信 号传导、细胞膜性结构张力维持等与actin纤维有 关的各种细胞活动 ^{[8, 9, 10, 11]} 。早期实验研究证实MYO1E 基因突变可引起鼠肾小球滤过屏障结构和功能损 伤 ^{[12, 13]} 。为探讨中国汉族SRNS患儿MYO1E基 因突变及其特点，本研究对4个中国汉族家族性 SRNS家系先证者进行MYO1E基因突变分析。 1　资料与方法 1.1　研究对象

2005~2010年期间南京军区福州总医院儿科 共收集到4个中国汉族常染色体隐性遗传型SRNS 家系，均来自福建省（图 1）。每个家系中均有 2例或2例以上患儿，共9例肾脏病患者，其中 男4例，女5例；1例患者首次就诊即诊断为 ESRD，8例诊断为SRNS；共有6例患儿进行了肾 活检，肾脏病理为FSGS（4例）和系膜增生性肾 小球肾炎（MsPGN）（2例）；进入ESRD 5例， 进入ESRD时间为1.2~8年，平均为6.4年；肾移 植3例，移植后随访7.5~11年无复发（表 1）。 本研究选取其中4例先证者为研究对象，男1例， 女3例，发病年龄为1.6~7岁，平均发病年龄4.3岁； 每个家系中先证者的父母均健康，尿检均正常， 无肾脏疾病家族史。对照组为59例尿检正常的健 康志愿者，其中男38例，女21例，年龄18~46岁。

图 14个中国汉族家族性SRNS家系图谱 罗马字母代表世代数，阿拉伯数字代表每世代各成员的编号。A系 谱图中Ⅲ7为先证者，7岁患肾病综合征，对激素耐药；Ⅲ4为先证者之姐；Ⅲ6系人工流产；Ⅱ5、Ⅱ6分别为先证者之父母， 尿检均正常。B系谱图中Ⅲ27为先证者，7岁患肾病综合征，对激素耐药；Ⅲ22为先证者之姐，已死亡；Ⅲ23为先证者之姐， 死于该病；Ⅲ24为先证者之兄，死于该病；Ⅲ25为先证者之兄，已死亡；Ⅱ13、Ⅱ14分别为先证者之父母，尿检均正常。 C系谱图中Ⅲ11为先证者，1岁8个月患肾病综合征，对激素耐药；Ⅲ10为先证者之兄，死于该病；Ⅱ7、Ⅱ8分别为先证 者之父母，尿检均正常。D系谱图中Ⅲ8为先证者，1岁7个月患蛋白尿（肾病水平），4年后进展至肾病综合征，对激素耐 药；Ⅲ6为先证者之兄，死于该病；Ⅲ11系自然流产；Ⅱ11、Ⅱ12分别为先证者之父母，尿检均正常。

表 1(Table 1)

表 1　中国汉族家族性SRNS患儿临床病理资料

表 1中国汉族家族性SRNS患儿临床病理资料

入选标准：（1）发病年龄介于3个月~18岁。 （2）一个家系至少有2个同胞患病，临床诊断 为SRNS。（3）汉族人；父母非近亲婚配，无肾 脏疾病家族史。肾病综合征（nephrotic syndrome， NS）和SRNS的诊断参照2009年3月中华医学 会儿科学分会肾脏病学组制定的诊断标准 ^[14] 。 NS的诊断标准：（1）大量蛋白尿：1周内3次 尿蛋白定性（3+~4+），随机或晨尿尿蛋白/肌酐 （mg/mg）≥2.0；24 h尿蛋白定量≥50 mg/kg； （2）低蛋白血症：血清白蛋白低于25 g/L； （3）高脂血症：血清胆固醇高于5.7 mmol/L； （4）不同程度的水肿。SRNS的诊断标准：泼尼 松足量[2 mg/(kg·d)或60 mg/(m²·d)]治疗大于4周 尿蛋白仍为阳性。ESRD的诊断标准 ^[15] ：内生肌酐 清除率<10 mL/(min·1.73 m²)，如无肾功能替代治 疗难以生存。

排除标准：（1）全身系统性疾病导致的肾损 害，如链球菌感染后肾小球肾炎、紫癜性肾炎、 狼疮性肾炎、乙型肝炎病毒相关性肾炎的病例； （2）肾脏病理为膜增生性肾小球肾炎、IgA肾病 和C1q肾病病例；（3）有小瞳孔或泌尿生殖系 统畸形或Wilms瘤等肾外表现的病例；（4）因 NPHS1、NPHS2、PLCE1、WT1和CD2AP基因突 变所致的病例。 1.3　基因组DNA提取

在获得南京军区福州总医院伦理委员会批准 和征得患儿监护人及对照人群知情同意的情况下， 取所有研究对象外周静脉血3 mL，10%枸橼酸钠 抗凝，用E.Z.N.A.TM SE Blood DNA试剂盒（美国 Omega）提取基因组DNA。 1.4　PCR扩增及DNA测序

采用Mele等 ^[4] 设计的引物扩增MYO1E基因 外显子1~28。应用ABI 3730XL DNA Analyzer测序 仪进行测序。对PCR产物进行正向和反向测序。 测序结果异常的DNA片段进行重新扩增，至少重 复2次，以验证结果的可靠性。 1.5　DNA序列变异命名

根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）的 GeneBank获得MYO1E基因组序列（NC_000015.9）、 mRNA序列（NM_004998.3）和蛋白质序列 （NP_004989.2），按照人类DNA序列变异命名 建议 ^[16] 命名MYO1E基因变异。 1.6　MYO1E基因突变的致病性预测

应用生物信息学软件对新发现的MYO1E基因 突变进行致病性预测：NetGene 2（http://www.cbs. dtu.dk/services/NetGene2/）。 2　结果 2.1　4例家族性SRNS先证者临床资料及治疗与 预后

4个SRNS家系的先证者分别是家系A的 Ⅲ7、家系B的Ⅲ27、家系C的Ⅲ11和家系D 的Ⅲ8（图1）。家系A先证者（Ⅲ7）为男孩， 7岁发病，尿蛋白4+，24 h尿蛋白3.59 g（参考 值50~80 mg/24 h），血清白蛋白<25 g/L（参考值 34~54 g/L），肾脏病理为MsPGN，应用足量激素 治疗4周，尿蛋白阳性，诊断为SRNS，14岁进 展至ESRD，16岁4个月时行肾移植术，移植后 7年6个月肾病无复发。家系B先证者（Ⅲ27） 为女孩，7岁发病，尿蛋白3+，24 h尿蛋白8.34 g， 血清白蛋白24 g/L，肾脏病理为FSGS，应用足量 激素治疗4周，尿蛋白阳性，诊断为SRNS，对其 它免疫抑制剂（霉酚酸酯、环磷酰胺和雷公藤多 甙）也无效应，15岁进展至ESRD，16岁6个月 时行肾移植术，移植后8年肾病无复发。家系C 先证者（Ⅲ11）为女孩，1岁8个月发病，尿蛋 白3+，24 h尿蛋白4.37 g，血清白蛋白23 g/L， 对激素和环磷酰胺耐药，随访至2岁4个月时尿 蛋白3+，肾功能正常，2岁10个月进入ESRD， 5岁时死亡。家系D先证者（Ⅲ8）为女孩， 1岁7个月发病，因排泡沫尿就诊，尿蛋白3+， 24 h尿蛋白定量67.75 mg/kg，但是患儿无水 肿，血清白蛋白30 g/L，血清胆固醇6.42 mmol/L （参考值1.15~4.70 mmol/L），尿素3.2 mmol/L （参考值2.5~6.4 mmol/L），肌酐28μmol/L （参考值27~62μmol/L），内生肌酐清除率 134.76 mL/(min·1.73 m²)[参考值<1岁65~80 mL/ (min·1.73 m²)；2岁以上80~126 mL/(min·1.73 m²)]， 诊断为蛋白尿，4年后该患儿血清白蛋白降至22 g/L； 患儿之兄7岁5个月发病，诊断为SRNS，肾脏病 理为FSGS，9岁死于肾功能衰竭；该先证者于发 病16 d后行肾活检，肾脏病理为FSGS，予以口服 足量泼尼松[2 mg/(kg·d)]，联合贝那普利（2.5 mg/d） 降尿蛋白治疗，足量激素治疗6周后尿蛋白 2+~3+，泼尼松逐渐减量并加用氯沙坦（12.5 mg/d）， 于病程4个月时加用环孢霉素A后蛋白尿能部分 缓解，随访至5岁7个月尿蛋白3+，血清白蛋白 波动于22 g/L，肾功能仍正常。 2.2　4例家族性SRNS先证者MYO1E基因检测 结果

在4例中国汉族家族性SRNS先证者中共检测 出25个MYO1E基因变异，分别是IVS1+90G>T、 IVS4+8G>A、IVS5-118C>T、IVS5-66A>G、 IVS5-53C>T、IVS8+13G>A、IVS8-56G>C、 IVS8-44G>A、1008C>T、IVS10+275G>A、 IVS10+328T>G、IVS13+216G>T、IVS15+162C>G、 IVS15+223G>A、IVS15-67G>A、IVS20+108A>C、 IVS21-85G>A、2673A>G、IVS24-341A>G、 IVS24-317T>A、IVS26+30C>T、IVS26+116C>T、 IVS27+84G>T、IVS27+457C>G和*14C>G。经检 索NCBI所属的PUBMED文献数据库和单核苷 酸多态性数据库（Single Nucleotide Polymorphism database,dbSNP Build 137），上述MYO1E基因的 25个变异中有24个为已经报道的SNP；MYO1E 基因IVS21-85G>A变异（图 2）在59例健康对照 中未检出，表明它是MYO1E基因突变，而且该突 变尚未见报道。见表 2。

图 2MYO1E基因IVS21-85G>A突变测序图 箭头所示为突变位点。

表 2(Table 2)

表2 4例中国汉族家族性SRNS先证者MYO1E基因检测结果

表 24例中国汉族家族性SRNS先证者MYO1E基因检测结果

IVS21-85G>A突变位于内含子区域，属非编 码区的碱基改变，采用NetGene 2平台（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）进行可变剪切位点的 预测。通过输入碱基改变前后的核苷酸序列，结果 该突变不在被预测的隐匿性剪切位点内，也不产 生其他隐匿性剪切位点数目和评分的改变。提示 MYO1E基因IVS21-85G>A突变为非致病性突变。 3　讨论

本研究采用PCR扩增MYO1E基因全部28 个外显子及其周围的部分内含子，对PCR产物进 行DNA直接序列测定，结果在4个SRNS家系的 先证者中未发现MYO1E基因纯合或复合杂合突 变，提示MYO1E基因突变不是本研究汉族家族性 SRNS家系的主要致病原因。

根据受累患儿的临床病理特点和家系系谱 图，本次研究4个家系均诊断为家族性SRNS， 且遗传方式均为常染色体隐性遗传。前期研究对 家系A、B和C的先证者进行NPHS1、NPHS2、 PLCE1、WT1和CD2AP基因突变分析，对家系D 进行NPHS1、NPHS2、WT1和CD2AP基因突变分 析，但是既未发现家系A、B和C的先证者携带 NPHS1、NPHS2、PLCE1、WT1和CD2AP基因纯 合或复合杂合突变，又未发现家系D的先证者携 带NPHS1、NPHS2、WT1和CD2AP基因纯合或复 合杂合突变 ^{[17, 18, 19]} 。近期Mele等 ^[4] 和Sanna-Cherchi 等 ^[5] 报道MYO1E基因突变所致家族性SRNS/FSGS呈常染色体隐性遗传，由此推测本次所研究的这4 个中国汉族家族性SRNS家系可能存在MYO1E基 因突变，因此对这4个中国汉族家族性SRNS家系 进行了MYO1E基因突变分析。

本次研究在家系D的先证者中检测出1个 MYO1E基因的IVS21-85G>A，但在59例尿检正常 的对照中未检出，表明该变异为MYO1E基因突变。 由于该变异位于内含子区域，属内含子突变，应 用NetGene2 server公共平台分析，显示该突变不 在被预测的隐匿性剪切位点内，也不产生其他隐 匿性剪切位点数目和评分的改变，表明其为非致 病性突变。MYO1E基因IVS21-85G>A突变在家系 D的先证者（Ⅲ8）中检出，且呈杂合状态；家系 D先证者在应用激素的基础上加用环孢霉素A 24 d 后尿蛋白转阴，提示家系D先证者可能系T细胞 功能紊乱所致。因此，MYO1E基因突变IVS21- 85G>A不是家系D先证者的主要致病原因。

本研究在4个SRNS家系的先证者中除了发现 1个MYO1E基因突变外，还检测出24个MYO1E 基因变异，分别是IVS1+90G>T、IVS4+8G>A、 IVS5-118C>T、IVS5-66A>G、IVS5-53C>T、 IVS8+13G>A、IVS8-56G>C、IVS8-44G>A、 1008C>T、IVS10+275G>A、IVS10+328T>G、 IVS13+216G>T、IVS15+162C>G、IVS15+223G>A、 IVS15-67G>A、IVS20+108A>C、IVS21-85G>A、 2673A>G、IVS24-341A>G、IVS24-317T>A、 IVS26+30C>T、IVS26+116C>T、IVS27+84G>T、 IVS27+457C>G和*14C>G。这24个MYO1E基因 变异在NCBI公共数据库dbSNP build 137中已报 道，表明这24个MYO1E基因变异是MYO1E基因 多态性。

与本研究报道相反，迄今欧美学者在常染色 体隐性遗传SRNS/FSGS家系中检测出2个不同的 MYO1E基因致病突变。Mele等 ^[4] 在来自欧美的 29个家族性FSGS患者和5个家族性DMS患者中 进行MYO1E基因突变检测，结果在意大利的一个 近亲婚配的FSGS家系中检出A159P纯合突变， 又在土耳其的一个FSGS家系中检出Y659X纯合 无义突变，其突变检出率为5.9%。Sanna-Cherchi 等 ^[5] 在来自欧美的9个家族性SRNS患者中进 行MYO1E基因检测，结果在一个意大利FSGS 家系中检出A159P纯合突变，其突变检出率为11.1%。与本研究报道一致，McCarthy等 ^[20] 在来 自欧美的5个家族性SRNS患者中未发现MYO1E 基因突变。此外，Mele等 ^[4] 在土耳其的一个FSGS 家系中检出MYO1E基因T876R杂合突变（PolyPhen 分值0.006），属非致病性。Sanna-Cherchi等^[5]在 意大利的1个家族性SRNS/FSGS先证者中同时检 出MYO1E基因杂合突变D185G（PolyPhen分值 0.593）和P1049H（PolyPhen分值0.079），但是 遗传分离分析显示D185G和P1049H突变均来自 母亲的1条染色体，是MYO1E基因单倍体，而且 此家系中另一个患儿不携带此突变，提示它们不 是该家族性SRNS/FSGS先证者的主要致病原因。 本研究与欧美国家在SRNS/FSGS家系中MYO1E 基因的检测结果存在差异，可能与不同种族具有 不同的遗传背景有关。

总之，本研究在4个中国汉族SRNS家系先 证者中共检测出24个已报道的MYO1E基因多态 性和1个未报道的非致病性MYO1E基因突变，提 示MYO1E基因突变不是本研究中国汉族家族性 SRNS家系的主要致病原因。

志谢：感谢北京大学第一医院丁洁教授在课题申 请方面给予的指导。