免疫性血小板减少症（immune thrombocyto- penia,ITP）是一种由血小板抗体介导的加速血 小板的破坏及抑制其生成的获得性自身免疫出血 性疾病。目前对于其发病机制尚不完全清楚。既 往研究发现 ITP 患者的细胞及体液免疫存在失衡 现象，是导致 ITP 患儿血小板减少的另一主要原 因 ^{[1, 2]}，但目前关于导致细胞及体液免疫失衡的机 制尚未完全明确。

白细胞相关免疫球蛋白样受体 -1（leukocyte- associated Ig-like receptor,LAIR-1）是一类含有 Ig 样胞外结构域的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超 家族成员，它可在多种免疫细胞膜上表达，也可 从细胞膜表面脱落至血清中成为可溶性 LAIR-1 （sLAIR-1）^[3]。LAIR-1 是一类抑制性受体，可 通过其所在细胞质的免疫受体酪氨酸抑制基序 （immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM）发挥其免疫抑制功能，从而使其所表达的免 疫细胞的功能失衡 ^[4]。已有研究报道显示 LAIR-1 的表达异常与系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等 免疫性疾病的发病机制相关 ^{[5, 6, 7]}。但在儿童 ITP 急 性期 LAIR-1 的表达是否存在异常现象，目前尚未 见相关报道。为此本研究对 ITP 患儿外周血 T 细 胞及B细胞膜LAIR-1、sLAIR-1的水平进行了检测， 以探讨 LAIR-1 在 ITP 发病中可能的机制。

参照 2009 年国际 ITP 工作组制定的儿童 ITP 诊断标准 ^[8]，选取 ITP 患儿 40 例，其中男 24 例， 女 16 例，平均年龄 32±29 个月（1~108 个月）， 均为我院住院治疗患儿；入院时平均血小板计数 19×109/L（1×109/L~40×109/L）；所有 ITP 患儿 均为急性期，受试前 4 周均未使用免疫抑制剂及 细胞毒性药物。同年龄健康对照组患儿 32 例，男 17 例，女 15 例，平均年龄 35±26 个月（3~120 个月），平均血小板计数 210×109/L。两组受试者 年龄及性别差异无统计学意义。本研究获受试者 家属知情同意，并通过医院医学伦理委员会批准。

FITC 标记 CD8+ T 细胞、CD19+ B 细胞、PE 标 记 LAIR-1、PerCP-cy5 标记 CD4+ T 细胞、APC-cy7 标记 CD20+ B 细胞抗体等均购自 BD Pharmingen 公 司；总RNA的提取及纯化试剂盒购自QiaGen公司； SYBRGeen 试剂盒购自德国 QIAGen；酶联免疫吸 附试验（ELISA）试剂盒购自武汉 EIAab 公司。

引物与酶：实时荧光定量 PCR 检测的引物根 据 GenBank 设计，由上海英骏（Invitrogen）公司 合成。LAIR-1 正向序列：5'-GGGGTCTCAGTGGTC-TTCCT-3'；3'-CCCCAGAGTCACCAGAAGGA-5'。 LAIR-1 反向序列：5'-TCCATTGACTGTGGCCTTG- T-3'；3'-AGGTAACTGACTCCGGAACT-5'。

在 ITP 患儿用药前采集外周静脉血 EDTA 抗 凝管1.5~2 mL，干燥管3 mL。为避免其他刺激干扰， 所有标本采集后均在 2 h 内处理。240 μL 全血用 作流式细胞仪分析；1 mL 提取总 RNA，-80℃保 存，批量纯化、cDNA 合成及 mRNA 检测；干燥管 3 mL 静脉血离心 20 min（1 000 r/min），分离上层 血清，分装至 EP 管中，-80℃保存，采用 ELISA 集中检测 sLAIR-1。

全血法配制流式上机液，采用流式细胞仪检 测 CD4+ T 细 胞、CD8+ T 细 胞、CD19+ B 细 胞、 CD20+ B细胞比例及其细胞膜上的LAIR-1的表达， 并设PE标记IgG1作同型对照，阴性表达控制在1% 左右，全部数据经 FlowJo 软件分析。

总 RNA 的提取及纯化：取外周血 1 mL，按 试剂盒说明步骤提取及纯化 RNA。抽取总 RNA 10 μL，按照逆转录试剂盒方法操作，进行逆转录 合成 cDNA，取 1 μL cDNA 进行 PCR 扩增 50~70 个循环。

采用SYBRGeen试剂盒，罗氏（LightCycler480） PCR 仪荧光定量检测总 LAIR-1 mRNA 表达水平， 应用 Relative Quantification 模式进行数据分析，结 果以目的基因 /β-actin GAPDH 比值表示。具体操 作步骤参照试剂说明书。

双抗夹心 ELISA 法检测 ITP 患儿血清 sLAIR-1 水平。具体操作步骤见试剂盒说明书。

所有数据分析采用 SPSS 17.0 统计软件包进 行，正态分布资料以均数 ± 标准差（x±s）表示， 非正态分布资料以中位数（四分位间距）[M（P25， P75）] 表示。经正态性和方差齐性检验后，采用 t 检验或非参数检验比较各组之间的差异，P<0.05 为差异有统计学意义。

ITP 组外周血 CD19+CD20+ B 细胞的比例较对 照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）； CD4+ T 细胞比例较对照组降低，差异有统计学意 义（P<0.05）；CD8+ T 细胞较对照组稍升高，但 两者差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1　两组免疫细胞亚群比例的比较　（x±s，% ）

表 1 两组免疫细胞亚群比例的比较　（x±s，% ）

ITP 组外周血 CD4+ T 细胞膜 LAIR-1 的表达 低 于 对 照 组（P<0.05）；CD8+ T 细 胞 膜 LAIR-1 表达低于对照组（P<0.05）；CD19+CD20+ B 细胞 膜 LAIR-1 的表达与对照组比较差异无统计学意义 （P>0.05）。见表 2、图 1、图 2。

表 2(Table 2)

表 2　两组细胞膜 LAIR-1 表达的比较　（x±s，% ）

表 2 两组细胞膜 LAIR-1 表达的比较　（x±s，% ）

图 1 CD4+、CD8+ T 细胞表达率及 LAIR-1 在 CD4+、CD8+ T 细胞膜的表达率流式细胞仪示意图　　 上排 为对照组，下排为ITP组。ITP组CD4+ T 细胞表达率较对照组降低，差异有统计学意义，而CD8+ T细胞 表达率较对照组稍增高， 但两者差异无统计学意义；LAIR-1 在 CD4+、CD8+ T 细胞膜上的表达率较对照组降低，差异有统计学意义。

图 2 CD19+CD20+ B 细 胞 的 表 达 率 及 LAIR-1 在 CD19+CD20+ B 细胞膜的表达率流式细胞仪示意图　　 上 排为对照组，下排为 ITP 组。ITP 组 CD19+CD20+ B 细胞 表达率较对照组升高，差异有统计学意义，但 LAIR-1 在 CD19+CD20+ B 细胞膜上的表达率与对照组比较差异无统计 学意义。

ITP 组血清 sLAIR-1 水平较对照组明显升高 （P<0.05），总 LAIR-1 mRNA 水平高于对照组 （P<0.05）（表 3）。

表 3(Table 3)

表 3　两组细胞膜 LAIR-1 表达的比较　（x±s，% ）

表 3 两组血清 sLAIR-1 水平及 LAIR-1 mRNA 表达的比较 [M（P25，P75）]

儿童 ITP 的发病机制尚不十分清楚，普遍认 为血小板的减少是由自身反应性 B 细胞和浆细胞 产生的抗血小板抗体介导所致 ^[9]，这些抗体通过单 核巨噬细胞系统的巨噬细胞的 Fcγ 受体诱导血小 板吞噬 ^[10]。近年研究发现 ITP 患儿 CD4+ T 细胞及 分泌的细胞因子也可影响 B 细胞产生抗血小板抗 体 ^[11]，另外 CD8+ T 细胞也可发挥其细胞毒作用 ^[12]， 对血小板进一步破坏。因此，ITP 的发病机制与机 体免疫功能失衡密切相关。

人 LAIR-1 是一种跨膜蛋白质，可抑制 B 细胞 的活化及增殖，同时减少相关抗体和细胞因子的 产生 ^[13]；也可抑制 T 细胞相关的 TCR 介导的信号， 最终可抑制 T 细胞活化、辅助体液免疫及细胞毒 性等功能 ^{[4, 14, 15]}。

对系统性红斑狼疮患者的研究发现 B 细胞膜 上 LAIR-1 的表达缺失，该研究认为因 LAIR-1 在 系统性红斑狼疮患者的 B 细胞上的缺失表达， LAIR-1 不能发挥其抑制作用，导致 B 细胞异常活 化，致使患者产生较多的异常抗体 ^[7]。同时，类风湿关节炎的患者关节液中血清可溶性 LAIR-1 的 表达水平均高于正常人，血清 sLAIR-1 可与膜型 LAIR-1 竞争结合配体，从而导致患者的免疫细胞 过度活化后发生免疫失衡 ^{[5, 6]}。

本研究结果显示，ITP 患儿中外周血 CD4+ T 细胞比例较正常对照组显著降低， CD8+ T 细胞较 对照组稍升高，CD19+CD20+ B 细胞的比例显著升 高，这与既往研究结果相似，说明 ITP 患儿体内 存在细胞及体液免疫失衡现象 ^{[11, 12]}。重要的是本 研究发现，ITP 患儿外周血 CD4+ T 细胞膜 LAIR-1 的表达降低，导致其对自身的细胞抑制功能减弱， 这可能使 CD4+ T 细胞参与的细胞免疫及辅助体液 免疫应答的功能增强，产生较多的抗血小板自身 抗体，介导单核巨噬细胞对血小板的吞噬；同时 CD8+ T 细胞膜 LAIR-1 降低，LAIR-1 对 CD8+ T 细 胞发挥的抑制性作用减弱，使其细胞毒性功能增 强，对血小板破坏增多。另外，研究结果中注意 到，LAIR-1 在 CD19+CD20+ B 细胞膜上的表达与 对照组比较差异无统计学意义，这提示膜 LAIR-1 并不影响体液免疫的抗体产生；但 ITP 患儿的 CD19+CD20+ B 细胞比例较对照组增高，前期研究 结果提示 ITP 患儿存在 Th2 细胞的过度活化 ^[16]， 推测由于 CD4+ T 细胞膜 LAIR-1 表达降低，加之 sLAIR-1 的增加，两者导致其对 T 细胞的抑制功能 减弱、Th2 细胞过度活化，后者促进体液免疫的 功能增强，从而使 B 细胞活化增殖。因此，推测 LAIR-1 主要是依靠对 T 细胞功能及其辅助体液免 疫应答的作用进行调节，从而导致 ITP 患儿机体 的免疫失衡。

另外，本研究发现 ITP 患儿血清中的 sLAIR-1 表达增加，这可能是由于位于细胞膜上的 LAIR-1 脱 落 至 血 清 所 致。 血 清 中 的 sLAIR-1 可 与 膜 LAIR-1 互相竞争配体，从而进一步使 ITP 患儿体 液及细胞免疫功能失衡。对 LAIR-1 mRAN 检测发 现，ITP 组患儿 LAIR-1 mRAN 表达高于对照组， 推测与以下因素有关：（1）由于细胞膜 LAIR-1 表达降低，而使 LAIR-1 mRNA 表达代偿性（反馈） 增加；（2）尽管 ITP 患儿的 LAIR-1 mRNA 转录 水平增高，但可能存在翻译过程的障碍。以上结 果进一步提示 ITP 患儿 LAIR-1 表达的变化在其发 病机制中起着重要的作用。

本研究发现 ITP 患儿 LAIR-1 在 CD4+ T 细胞、CD8+T 细胞膜 LAIR-1 的表达降低致使对免疫细胞 的抑制功能减弱，血清中 sLAIR-1 的表达升高进 一步削弱了膜 LAIR-1 的抑制功能，提示 LAIR-1 可能是导致 ITP 患儿的免疫失衡的重要因素。有 待进一步研究 ITP 患儿经激素及丙种球蛋白治疗 后是否可调控细胞膜及血清中LAIR-1的表达变化， 或通过影响 T 细胞及 B 细胞的功能、体内细胞因 子水平^[17]，从而间接调控细胞膜上 LAIR-1 的表达。 概括起来，本研究证实了细胞膜上 LAIR-1 与小儿 ITP 体液及细胞免疫功能紊乱的机制相关，血清中 LAIR-1 可能参与细胞膜上 LAIR-1 发挥抑制功能的 调控。深入探讨 LAIR 在 ITP 发病机制中的作用， 可进一步了解导致 ITP 免疫功能紊乱的机制。