2. 郑州大学第一附属医院, 河南 郑州 450052;
3. 洛阳市中心医院, 河南 洛阳 471000
近年来,端粒、端粒酶与细胞衰老、癌变及 DNA修复的密切关系逐渐引起国内外学者的关注。 再生障碍性贫血(简称再障)是常见的骨髓衰竭 性疾病,既往研究表明,携带端粒酶基因突变的 再障患者端粒酶活性下降,外周血单个核细胞端 粒长度缩短[1]。而儿童造血骨髓容量相对多于成人, 且骨髓造血功能代偿能力较强,实验显示,再障 患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性升高 [2],那么其有无端粒酶基因突变,外周血端粒长度的变化如何, 本文拟就此进行初步研究,旨在探讨再障患儿端 粒长度变化及意义。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取 2011 年 6 月至 2013 年 6 月于郑州大学 第一附属医院及第三附属医院就诊的慢性再障患 儿 69 例为研究对象,其中初次确诊且未接受免 疫抑制治疗(immunosuppressive therapy,IST)者 24 例(未经 IST 组),男 10 例,女 14 例,年龄 3~13 岁,平均年龄 7.7±2.8 岁;接受 IST 后基本 治愈、缓解及明显进步患儿 36 例(IST 有效组), 男 19 例,女 17 例,年龄 4~16 岁,平均年龄 7.9± 2.6 岁,中位随访时间 16 个月(6~33 个月);接 受 IST 后无效(一般指经 1 年以上治疗无明显进 步)者 9 例(IST 无效组),男 5 例,女 4 例,年 龄 5~14 岁,平均年龄 8.2±2.9 岁,中位随访时间 18个月(8~36个月)。诊断标准及疗效标准参考《小 儿再生障碍性贫血诊疗建议》 [3],3组患儿在性别、 年龄、病程、血象等方面比较差异均无统计学意 义(均 P>0.05),具有可比性。随机选择同期于 郑州大学第三附属医院进行体检的年龄及性别匹 配的健康儿童 35 例为对照组,男 19 例,女 16 例, 年龄 3~16 岁,平均年龄 7.4±3.1 岁。所有研究对 象取外周静脉血 2 mL,EDTA 抗凝,置于 -80℃冰 箱保存。
1.2 治疗方案本研究中患儿采用的治疗方案为免疫抑制剂 (环孢素 A)与雄激素(司坦唑醇)联合治疗, 用药方法如下:环孢素 A(田可)3~5 mg/(kg · d), 分 2 次口服,定期监测血药浓度,维持在 200~ 400 ng/L;司坦唑醇(康力龙)0.1~0.3 mg/(kg · d), 分 2 次口服。有出血倾向的患儿给予醋酸泼尼松 0.5 mg/(kg · d),分 2~3 次口服。治疗期间定期复查 血常规、网织红细胞、肝肾功能,对有感染、严 重贫血或出血者酌情应用抗生素,输注红细胞或 血小板。IST 有效组 1 例患儿治疗中曾接受兔抗人 胸腺细胞免疫球蛋白针(ATG)(即复宁)治疗, 剂量为 0.25 mg/(kg · d),连续应用 5 d。
1.3 主要试剂及仪器Blood Genome DNA Extraction 试剂盒和 SYBR? Premix Ex TaqTM 试剂盒均购自大连 TaKaRa 有限 公司;2×Taq PCR Master Mix 购自上海莱枫生物 科技有限公司;引物由上海 invitrogen 生物技术有 限公司设计合成;1×TE buffer(pH=8.0)、异丙醇、 乙醇由实验室提供。实时荧光定量 PCR 仪为 ABI Prism?7500 型荧光定量 PCR 仪(应用系统生物公 司,美国)。
1.4 端粒长度检测 1.4.1 外周血基因组 DNA 提取及标准品制备取 EDTA 抗凝血 2 mL,严格按照试剂盒步骤提取 外周血基因组 DNA,利用 Nanodrop1000 分光光度 计测定 DNA 浓度及纯度,所有样品 OD260/OD280 在 1.6~1.9 之间,取任一正常组 DNA 作为标准品, 按 2 倍浓度比依次稀释为 100 ng/μL、50 ng/μL、 25 ng/μL、12.5 ng/μL、6.25 ng/μL 五 个 系 列 [4], 采用 1×TE buffer 将其余样品 DNA 浓度调整至 10 ng/μL,所有DNA样本放入-20℃冰箱保存待测。
1.4.2 端粒长度的测量利用实时荧光定量 PCR(Real-Time-PCR)测定相对端粒长度,PCR 反应分为两部分,分别检测样品端粒(tel)及内 参 36B4 基因 PCR 扩增的 Ct 值。每次反应均设 标准曲线,每样品设 3 个复孔。参照文献 [5]设 计引物序列如下:tel-F:5'-CGGTTTGTTTGGGT- TTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3',tel-R: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCC- TTACCCT-3', 产 物 片 段 长 度:76 bp;36B4-F: 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3',36B4-R: 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3', 产 物 片段长度:63 bp。反应体系为 20 μL:2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL, 样品 DNA 3 μL,端粒长度扩增引物(10 μM): tel-F 0.6 μL,tel-R 1 μL;内参基因上下游引物 (10 μM)均为 0.4 μL,用去离子水调整终体积 为 20 μL。反应条件:95℃预变性 30 s;95℃变性 5 s,60℃ 退火 34 s,40 个循环。
采用荧光定量 PCR 仪配套软件,分别确定样 品端粒及内参 36B4 基因 PCR 扩增的 Ct 值,在定 量 PCR 中端粒(T)重复拷贝的比率同单拷贝基因 (S)的比率即 T/S 是确定的,T/S 比率同端粒长度成正比例关系,端粒长度就可以根据 T/S 来测定。 △ Ct = Cttel-Ct36B4,相对 T/S 比率 = 2 -(△ Ct1- △ Ct2)= 2- △△ Ct,△ Ct1 为每个样品 T/S 比率,△ Ct2 为参 考 DNA 的 T/S 比率,根据此公式可计算出每个样 本的相对 T/S 值,该值与样品 DNA 的相对端粒长 度对应。
1.5 端粒酶基因突变检测利用 PCR 方法扩增文献报道中发生突变 率较高的 TERC 基因及 TERT 基因第 1、2 外显 子,PCR 反应体系 20 μL:2×Taq PCR Master Mix 10 μL, 样 品 DNA 2 μL, 上 下 游 引 物(10 μM) 各 0.5 μL,DMSO 0.8 μL,ddH2O 6.2 μL。 参 照 文 献 [6, 7]设 计 引 物 序 列 如 下:TERC-F: 5'-TCATGGCCGGAAATGGAACT-3',TERC-R: 5'-GGGTGACGGATGCGCACGAT-3', 产 物 片 段 长 度:1 182 bp;TERT1-F:5'-GAGTTTCAGGCAGCG- CTGCGTC-3',TERT1-R:5'-CTTGTCGCCTGAGG- AGTAGAG-3',产物片段长度:999 bp;TERT2-F: 5'-CAGGACGCGTGGACCGAGTGACC-3', TERT2-R:5'-GTGAACCTCGTAAGTTTATGC-3', 产物片段长度:653 bp。反应条件:96℃预变性 5 min;96℃变性 35 s,63℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,共 35 个循环;72℃再延伸 3 min。将 PCR 产物送至南京金瑞斯生物科技有限公司进行纯化 测序。测序结果应用 DNAStar 进行序列分析,并 与 Pubmed BLAST 中正常 TERC、TERT1、TERT2 基因序列进行比对。
1.6 统计学分析采用 SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行统计 学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示, 多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较 采用 SNK-q 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 端粒及内参 36B4 基因 Real-Time PCR 结果端粒及内参 36B4 基因 Real-Time PCR 扩增产 物特异,适合定量,见图 1~2。
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图 1 端粒Real-Time PCR结果 A:端粒基因扩增曲线;B:端粒基因融解曲线,*为荧光强度对温度的一阶负导数; C:端粒基因 PCR 产物 2.5% 琼脂糖凝胶电泳图,M:marker;1~2:端粒 PCR 产物;3:无引物对照;4:无模板对照。 |
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图 2 36B4 基因 Real-Time PCR 结果 A:36B4 基因扩增曲线;B:36B4 基因融解曲线,* 为荧光强度对温度 的一阶负导数;C:36B4 基因 PCR 产物 2.5% 琼脂糖凝胶电泳图,M:marker;1~2:36B4 基因 PCR 产物;3:无引物对照; 4:无模板对照。 |
各组儿童端粒长度相对 T/S 比率比较差异有 统计学意义(F=6.142,P=0.001)。未经 IST 组 (0.64±0.22)、IST 无效组(0.61±0.26)端粒长 度相对 T/S 比率小于正常对照组(0.98±0.37)和 IST 有效组(0.88±0.40)(均 P<0.01),IST 有效 组端粒长度相对 T/S 比率同正常对照组相比差异无 统计学意义(P>0.05)。
2.3 端粒酶基因测序结果根据 PCR 检测结果,69 例患儿均未发现 TERC、TERT1、TERT2 基因突变。
3 讨论再障是由多种病因、多种机制引起的一种骨 髓造血功能减低或衰竭,导致全血细胞减少的综 合征,目前认为 T 淋巴细胞异常活化、功能亢进 造成骨髓损伤、造血细胞凋亡和造血功能衰竭在 获得性再障发病机制中占主要地位。外界因素, 如药物、射线、化学物质等也可以诱发疾病的发 生,但是在同样的暴露条件下,并非每个人都发 病,提示基因的个体差异影响其疾病的易感性。 随着生物科学技术的进步,越来越多的研究表明, 端粒和端粒酶与细胞的寿命、衰老、死亡密不可 分 [8]。再障作为一种骨髓衰竭性疾病,其发生与发 展过程中端粒及端粒酶的作用就引起越来越多学 者的关注。
端粒是真核细胞内线性染色体末端的一 种特殊“帽状”结构,人类的端粒由重复序列 (TTAGGG)n 及 端 粒 结 合 蛋 白 组 成, 长 约 5~15 kb,其功能是保护染色体的完整性和维持细 胞的复制能力。细胞分裂一次其端粒 DNA 丢失约 30~200 bp,端粒长度随细胞的复制和分裂而进行 性缩短,达到一定程度(2~4 kb),细胞走向衰老 死亡。端粒的维持和延长有赖于端粒酶的活性, 端粒酶通过引物特异识别位点,以自身 RNA 为模 板,在染色体末端合成端粒DNA,使端粒得以延长。 人类端粒酶主要由三种组分构成,即端粒酶 RNA 组 分(telomerase RNA component,TERC), 逆 转 录酶组分(telomerase reverse transcriptase,TERT) 和端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein, TP)[9]。
国外研究显示,有 10% 的再障患者中检测出 端粒酶基因突变,其中 TERC、TERT 基因突变各 占约 4%,而另一小部分患者则有编码端粒结合蛋 白基因的突变,这些患者外周血白细胞端粒均较 同龄健康对照组缩短,并且端粒酶活性降低 [10], 提示这些基因突变均与端粒异常缩短有关。但 Field 等 [11]研究了 284 例血液病患儿 TERC 基因突 变,其中 109 例再障患儿中未发现有意义的 TERC 基因突变。日本研究者 Liang 等 [12]分析了 96 例儿 童再障患者的 TERC 以及 TERT 突变,仅有 2 例患 者存在 TERT 基因突变。这些研究表明端粒酶基因 的表达在成人和儿童再障中存在差异。由于样本 量的限制,本研究未能对 TRET 所有外显子进行基 因突变检测,在已检测的 TERC 及 TERT 基因序列 中尚未发现突变,端粒酶基因在儿童再障中的表 达情况还需进一步的研究。
研究中未经 IST 及 IST 无效的再障患儿端粒 长度较正常儿童显著缩短,而接受 IST 后血象恢复 的患儿端粒长度与正常组比无明显缩短,提示在 再障患儿疾病初期,由于各种原因引起骨髓造血 衰竭,造血干 / 祖细胞出现量和(或)质的缺陷, 从而导致剩余细胞大量复制,过度代偿造血而导 致继发性端粒缩短 [13],端粒缩短加速后,端粒酶 活性升高来维持正常的端粒长度。由于儿童有较 强造血功能代偿能力,经免疫抑制治疗后,造血 干细胞造血能力恢复,端粒酶活性的增高可以进 一步促使端粒延长[14],使之恢复至正常年龄水平。 而端粒酶基因突变使端粒酶活性不足以代偿端粒 缩短现象,导致造血干细胞自我更新及增生潜能 下降,端粒持续缩短至关键长度,细胞死亡,因 而有基因突变的患者预后较差。在本研究中,在 对免疫抑制及治疗无效患儿中,未发现端粒酶基 因突变,仍有端粒长度缩短。一方面其它如氧化 应激、感染等因素都会对端粒长度产生影响 [15]; 另一方面,可能有研究尚未发现的端粒及端粒酶 相关蛋白基因改变。对再障患儿端粒长度缩短的 机制有待进一步深入研究。
目前认为,免疫异常在再障发病中起重要作 用,大部分再障患儿经免疫抑制治疗后获得长期 生存 [16],但经随访观察,发现部分患儿疾病出现 不同转归,有一部分发展为骨髓异常增生综合征 (MDS)和急性白血病等,即使骨髓移植后也有一定比例的基因病发生率 [17]。这提示对免疫抑制 剂治疗无效的患儿,有必要检测其外周血或骨髓 有核细胞的端粒长度及端粒酶活性,对于有端粒 酶基因突变或者端粒明显缩短的再障患者,应尽 早行造血干细胞移植。同时有研究发现有突变患 者的亲属也具有造血障碍,揭示了基因突变的家 族倾向 [18]。因此端粒长度及端粒酶基因突变的检 测也有助于捐献者选择。
综上所述,端粒和端粒酶与儿童再障的发生 发展有一定的相关性,但两者是否具有一定的因 果关系,端粒的异常是疾病的始发因素还是中间 环节,患儿端粒的改变能否用于评估预后及指导 治疗,都需要更加深入的探索发现。
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