Rett 综合征（Rett syndrome,RTT）是一种严 重影响儿童精神运动发育的疾病，由 Rett 于 1966 年首次报道，是女性严重智力低下的重要原因； 女性的发病率为 1/10 000~1/15 000 ^[1] 。1999 年 Amir 等^[2] 用定位候选基因的方法确定 RTT 的致病基因 是位于染色体 Xq28 区域的甲基化 CpG 结合蛋白-2 （MECP2）基因，随后研究人员开始对 RTT 进行 MECP2 基因检测，目前世界范围内已经报道了超 过 780 多 种 突 变 类 型（The Human Gene Mutation Database,http://www.hgmd.org）。研究发现大约在 90%~95% 的典型 RTT 及 40%~50% 的非典型 RTT 患者中可检测到 MECP2 基因突变^[3]，我国总的突 变检出率约为 84%^[4] 。本研究通过对 9 例散发 RTT 患儿的临床特点及 MECP2 基因测序分析，了解这 些 RTT 患儿突变情况，为临床诊断在分子水平提 供依据。

1　资料与方法 1.1　研究对象

选取 2012 年至今在本院神经内科和康复科诊 断的 9 例 RTT 患儿为研究对象，均为女孩，发病 年龄 5~42 个月。临床诊断符合 2001 年欧洲小儿 神经会议制定的国际 RTT 诊断标准^[5]。本研究得 到武汉市儿童医院伦理委员会的批准。

1.2　基因突变检测

取患儿及其父母外周静脉抗凝血2 mL， 分离白细胞后用酚-氯仿方法提取基因组 DNA。扩增MECP2编码区所需要的引物由上 海生工公司合成，3个外显子序列分别为： 1F：5'-GCTAGGTAAGCTGGGAAATAGC-3'， 1R：5'-CACAGTTTGGCACAGTTATGTC-3'； 2F：5'-AAGATCTGAGTGTATGATGGCC-3'， 2R：5'-GCACATACATTTTCCTGCTCC-3'； 3F：5'-GTTTGTCAGAGCGTTGTCAC-3'，3R： 5'-AAGCTTTGTCAGAGCCCTAC-3'。PCR 总反应体 系为 25 μL，其中含 100 ng DNA 1 μL，50 pmol/L 上 下游引物各1 μL，200 μmol/L dNTP 2 μL，1U Taq DNA 聚合酶（TAKARA 公司 5U/μL）0.2 μL，用无 菌蒸馏水补到 25 μL。在 Bio-rad PCR 仪器上进行 扩增，PCR 条件为 94℃变性 30 s，56℃退火 30 s， 72℃延伸 30 s，循环 32 次。产物经 2% 琼脂糖凝 胶电泳合格后进行测序分析。

2　结果

9 例患儿均具有 RTT 的症状：即语言功能降 低或者丧失；手的技能降低，且部分患儿存在单 一模式手的刻板动作；坐和走的功能受限；多数 患者脑电图显示异常；发育落后于同龄儿童。这 9 例患儿中发现 5 例存在 MECP2 基因突变，1 例 为碱基插入造成的移码突变（c.913insT），该突变 导致 MECP2 基因所编码的蛋白从第 305 位氨基酸 起序列发生改变，且在第330 位氨基酸处提前终止， 该突变未见报道，为新发现突变；2 例为错义突变 （R106W 和 P376S）；2 例为无义突变（R168X 和 R270X）。在这些突变中，1 例突变位于外显子 3 上（R106W），其余几个突变均位于外显子 4 上（表 1~表 2）。所有患儿父母均未检测到突变。

Table 1">表 1(Table 1">Table 1)

表 1　RTT 患者的临床特点 注： Y 表示有突变；ND 表示未见突变；－表示信息不详。

表 1　RTT 患者的临床特点

Table 2">表 2(Table 2">Table 2)

表 2　RTT 患者 MECP2 基因突变情况 注：MBD 为甲基化 CpG 结合区；TRD 为转录抑制区；CTS为 C 末端区；－表示功能区以外的区域。

表 2　RTT 患者 MECP2 基因突变情况

9 例患儿中，1 个突变位于甲基化 CpG 结合 区（MBD），2 个突变位于转录抑制区（TRD）， 1 个位于蛋白C 末端区域（CTS），还有1 个突 变位于功能区以外的区域，突变在 MeCP2 蛋白上 的分布如图 1 所示。通过分析发现 2 例（D、G） TRD 功能区有突变的患儿均表现出不说话、脑电 图癎性放电以及发育明显落后的临床特点。

Figure 1">图 1

Figure 1">Fig. 1

图 1　MECP2 蛋白的结构与功能区划分[6] 及患者 MECP2 基因突变的位置分布

3　讨论

RTT 是引起女孩智力低下最常见的原因之一， 多数为散发，临床上分为典型和非典型两类。RTT 患儿一般在 6~18 个月之前表型基本正常，之后会 逐渐表现出智力低下等临床症状^[7]。

该病的致病基因 MECP2 编码 X 连锁的甲基化 CpG 结合蛋白-2，是一种高丰度的染色质结合蛋 白^[8]。该蛋白共有 486 个氨基酸，包含 2 个主要功 能区：即 MBD 和 TRD^[9]。MECP2 不仅可以通过调 节 DNA 甲基化途径影响甲基化过程，还可以作为 转录抑制因子调节基因转录，从而维持与修饰神 经元成熟。因此，如果 MECP2 基因产生突变导致 其编码的蛋白功能异常，可能对神经系统的生长 和发育造成损害^[10]。

本研究的 9 例患儿中 5 例 MECP2 基因发生突 变，其中 4 例为 C 突变为 T，与国外报道的 80% 以上的点突变为 C 突变为 T 一致^[11]。

患者 A 突变位于 MBD 区域，该区含有 85 个 氨基酸，为蛋白质染色质定位所需^{[2, 9]}，该突变可 能改变蛋白的二级结构，导致 MECP2 蛋白与 5-甲 基胞嘧啶的结合能力下降。患者 D 和 G 突变位于 TRD 功能区，该区由 104 个氨基酸组成，它与组 蛋白脱乙酰化酶和转录因子 SIN3A 相互作用发挥 转录抑制作用^{[2, 9]}。患儿 D 的 MECP2 基因突变以 后使得第 270 位氨基酸由精氨酸变为终止密码子； 而患儿 G 的 MECP2 基因外显子 4 插入一个碱基， 产生移码突变使从第 305 位氨基酸（赖氨酸）起 氨基酸序列改变，并在第330 位氨基酸处提前终止， 这 2 例患儿均产生截短的 MECP2 蛋白。这两个突 变可能改变了 TRD 的结构，影响了其转录抑制功 能。患儿 B 突变位于 CTS 区域，推测该区域的突 变影响 TRD 的功能。患者 F 突变虽不在这几个功 能区内，但是该突变使 MECP2 蛋白截短，在 TRD 区域前表达终止，因此 F 患者的 MECP2 蛋白功能 部分或者全部丧失。

有研究对北美国际 Rett 数据库（IRSA,http:// MECP2.chw.edu.au）中的病例统计分析发现超过 80% 的 RTT 患者存在 MECP2 基因突变，剩余的近 20% 突变检测阴性；因此推测可能有其他致病基 因。研究发现一些 RTT 患者中细胞周期依懒性激 酶样 5 蛋白（CDKL5）存在突变^[11]。接下来本课 题组将对 MECP2 突变阴性的患者进行 CDKL5 致 病基因的检测。

国内外都有 MECP2 基因突变和 RTT 患儿表 型的研究，包括突变类型以及突变位置的不同对 患者的影响，但是结论不一致[12-13]，可能原因是 病例数较少及对临床症状的评分标准不同。本研 究发现位于 TRD 区域的突变表现出不说话、脑电 图癎性放电以及发育明显落后的临床特点，但是 本研究病例较少，不能得出肯定结论，将收集更 多病例进行统计分析，明确基因型和表型的关系。

综上所述，本研究结果和国内外其他研究组 基本一致，MECP2 基因检测可帮助临床进行诊断， 特别是对于临床症状未显现出来的患儿可以尽早 确诊，从而做到早诊断、早干预。