胆汁淤积是指胆汁流的形成和排泌障碍，可 由肝细胞或胆管上皮的胆汁分泌障碍或胆汁流的 阻断所致，其结果可导致胆汁酸等毒性物质的潴 留，引起肝细胞损伤和胆汁淤积性肝病^[1]，其机制 和胆汁成分的合成、分泌、解毒和转运等方面关 系密切^[2]。发生在婴儿（包括新生儿）期称婴儿胆 汁淤积。引起婴儿胆汁淤积的主要原因是婴儿肝 炎综合征（infantile hepatitis syndrome,IHS），若不 及时进行有效治疗可发展为胆汁性肝硬化，最终 因肝功能衰竭或合并肺炎而死亡，严重影响婴儿 的生存质量甚至威胁生命^{[3, 4]}。目前临床上治疗胆 汁淤积的常用药物包括熊去氧胆酸（UDCA）和皮 质激素，但其治疗疗效尚不满意^[5]。中药大黄已应 用于临床治疗肝内胆汁淤积。大黄素（6-甲基-1,3,8-三羟基蒽醌）是大黄中分离出来的主要有效单体， 具有肝保护作用及抗炎、抗病毒、抑菌、免疫调节、 促进胃肠蠕动、抗氧化、清除自由基、改善微循 环等药理作用^{[6, 7, 8, 9, 10]}。前期研究已证实大黄素具有治 疗α-异硫氰酸萘酯（alpha-naphthylisothiocyanate, ANIT）诱导的急性肝内胆汁淤积性肝损伤作用 ^[11]。

近期研究发现，核受体法尼醇X 受体（farnesoid X receptor,FXR）是胆汁成分代谢的中心环节，目 前被认为是治疗胆汁淤积的关键靶点^{[1, 12]}，FXR 对 胆汁酸的合成、解毒和转运，以及肝纤维化形成 等方面均有作用。ANIT 诱发肝损伤的生物化学和 病理形态学改变与人肝内胆汁淤积性肝病相似， 目前为国际公认用来制作淤胆型肝炎动物模型的 药物^{[13, 14]}，本研究采用 ANIT 建立急性淤胆型肝炎 的动物模型，并以此动物模型研究 FXR 在淤胆型 肝炎肝组织中的表达及大黄素的干预作用。 1　材料和方法 1.1　实验动物及分组

健康雄性清洁级 Sprague-Dawley（SD）大鼠 90 只，体重 200±20 g，年龄 6±1 周，购自华中 科技大学同济医学院实验动物中心。将动物随机 分成正常对照组、模型组和大黄素干预组，各组 又依据造模后不同干预时间分为 24、48、72 h 三 个亚组，每个亚组 10 只大鼠，分笼饲养，标准饲 料喂养，自由饮水，控制室温 25±2℃，在开始实 验前先适应性喂养 3 d。 1.2　药物、试剂与仪器

大黄素粉（纯度 >98%，批号：26110401）购 于西安崇信天然添加剂有限公司，ANIT 购于美国 Sigma 公司。TRIzol 溶液购自美国 Invitrogen 公司， SYBRGreen Ⅰ荧光染料购自闪晶生物基因技术公 司，逆转录酶和 RNA 酶抑制剂购自日本 Toyobo 公 司。苏木素购自美国Sigma 公司，伊红Y、无水乙醇、 盐酸、二甲苯、包埋石蜡、中性树胶均购自国药 集团药业股份有限公司。PCR 仪为美国 Stratagene 荧光定量PCR 仪（Mx3000P）。血清总胆红素（TB）、 直接胆红素（DB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT） 和胆汁酸（TBA）均由美国雅培（Abbott）Aeroset 全自动生化分析仪检测。 1.3　药物配制

大黄素粉用羧甲基纤维素钠配成 0.4% 的悬 液，ANIT 用麻油配成1% 的溶液，均于临用前配制， 使用前摇匀。 1.4　给药方法

大黄素干预组给予大黄素 20 mg/(kg · d) 灌胃， 大黄素剂量参考文献^[11] 用药剂量，模型组和正常 对照组均给予等体积羧甲基纤维素钠溶液灌胃， 以上给药方式连续 4 d。 1.5　造模方法

除正常对照组外，其他 2 组均于实验的第 5 天按文献^{[13, 14]} 给予 1%ANIT 麻油溶液 50 mg/kg 一 次灌胃，灌胃前后 12 h 所有动物均禁食不禁水， 以保证所灌药物充分均匀地吸收，正常对照组则 只给予等体积麻油灌胃。造模 4~6 h 后大黄素干预 组继续给予大黄素 20 mg/(kg · d) 灌胃，模型组和正 常对照组则仍给予等体积羧甲基纤维素钠溶液灌 胃，直至造模后 24、48、72 h 处死相应的动物。 1.6　胆汁引流及标本采集

各组大鼠经 6% 水合氯醛 250 mg/kg 腹腔注射 麻醉后，逐层剪开腹腔，分离出胆总管，结扎胆 囊底部，在胆总管中部剪一“V”型切口，插入引 流管（用腰穿管制成），引流 1 h 胆汁，计量并收 集 1 mL。分离腹主动脉，抽取 2 mL 动脉血置促凝 管内，4 000 r/min 离心 10 min，吸出血清，-20℃ 冰箱保存待检。抽血后取部分肝组织，生理盐水 冲洗，立即放入液氮中保存待检。另取每只大鼠 的同一叶肝脏置于４% 多聚甲醛液固定 48 h，脱 水后常规石蜡切片。 1.7　病理学检查

取４% 多聚甲醛液固定的肝组织，按常规方 法脱水、石蜡包埋、4 μm 连续切片、苏木精 - 伊 红（HE）染色，每只大鼠取 6 张切片照相，显微 镜下观察肝组织病理变化。 1.8　实时荧光定量 PCR 检测肝组织 FXR mRNA表达

采用 TRIzol 提取肝组织总 RNA。以总 RNA 为模板，逆转录成 cDNA，使用高亲合力双链 DNA 结合染料 SYBR green I 在 Mx3000P 检测系统进行 实时荧光定量 PCR。FXR 引物序列（149 bp）： 上 游：5'-GAGAGATGGGAATGTTGGCTG-3'， 下 游：5'-CTTGGTCGTGGAGGTCACTT-3'； β-actin 引 物 序 列（237 bp）： 上 游： 5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'，下 游： 5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'。扩增条件： 95 ℃变性 30 s，62 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 30 s， 85℃再延伸 8 s，每个循环在 85℃时检测荧光强度， 共 38~40 个循环。扩增结束后，将实时定量 RTPCR 产物从 68℃缓慢而均匀地升温至 95℃，温度 每升高 0.2℃读一次荧光值，每两次读值间隔 1 s。 对PCR 扩增产物定量后分级10 倍稀释做标准曲线。 FXR mRNA 表达水平以其与 β-actin 的相对表达量 来计算。 1.9　统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以均数 ± 标准差（x±s）表示，多 组间比较采用 one-way ANOVA 分析，在有差异性 的情况下进一步采用SNK-q检验行组间两两比较， P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组大鼠生活状态及肝组织肉眼观察情况

正常对照组大鼠有活力，毛发柔顺有光泽， 尿色清亮，肝组织表面红润光滑，实施胆汁引流 时见胆汁顺利流出；模型组大鼠缺乏活力，毛发 凌乱、失去光泽，活动及进食均减少，尿色深黄， 肝组织失去红润光滑的外表，部分见黄色结节， 24 h 时胆汁流量减少，48 h 时胆汁流中断，72 h 时胆汁流开始恢复，但仍少于正常，肠管扩张明 显，部分见中毒性鼓肠；大黄素干预组大鼠活动 及进食均较模型组明显改善，尿色较模型组变浅， 肝组织黄色结节减少，48 h 时可引流出胆汁，肠 管扩张亦减轻。 2.2　各组肝组织病理形态学表现

正常对照组在 24、48、72 h 时间点肝组织的 肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞大 小一致，染色均匀，胆管上皮细胞完整，未见中 性粒细胞浸润。模型组大鼠造模后 24 h 肝组织即 可见明显病理改变，肝小叶结构破坏，肝细胞广 泛水变性和羽毛样变性，汇管区胆管上皮细胞肿 胀，可见脱落的胆管上皮细胞及脱落缺陷区，并 见明显的中性粒细胞浸润；48 h 变化更明显，肝 细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝细胞核大小不一致， 核内染色质聚集，核仁粗大浓染，可见多个点状、 灶状坏死区，枯否细胞增生，胆管上皮细胞增生 明显，管腔狭窄，腔内可见大量坏死脱落细胞， 部分胆管上皮细胞内及胆小管内见胆栓形成，胆 管周围有大量中性粒细胞浸润，肝细胞点状、灶 状坏死区多局限于胆管周围的肝细胞；72 h 时以 上病变均减轻，但仍可见坏死灶和中性粒细胞浸 润。大黄素干预组在各时间点肝组织病理改变均 较模型组明显减轻，中性粒细胞浸润明显减少。 见图 1。

图 1各时间点各组大鼠肝组织病理形态学表现（苏木精 - 伊红染色，×400）正常对照组各时间点肝小叶结构完整，肝细 胞索排列整齐，肝细胞大小一致。模型组 24 h 肝小叶结构破坏，肝细胞广泛水变性（箭头所示），并见中性粒细胞浸润；48 h 肝细胞变性 较 24 h 更严重，见气球样变（黑色箭头所示）和灶状坏死区（红色箭头所示）；72 h 肝细胞病变开始恢复，胆管上皮细胞增生（箭头所示）。 大黄素组各时间点肝细胞病变均较模型组减轻。

造模干预后各时间点，模型组大鼠血清 ALT、TB、DB、TBA 水平较对照组均显著增高 （均P<0.05），大黄素干预组大鼠血清ALT、 TB、DB、TBA水平均较模型组显著降低（均 P<0.05）；除 72 h TB 水平外，大黄素干预组在其 他各时间点 ALT、TB、DB、TBA 水平仍高于对照 组（均P<0.05）。见表 1~3。

表 1(Table 1)

表1　24 h 各组血清生化指标水平及肝组织 FXR mRNA 表达变化（x±s） 注：a 为与对照组比较，P<0.05；b 为与模型组比较，P<0.05。

表 124 h 各组血清生化指标水平及肝组织 FXR mRNA 表达变化（x±s）

表 2(Table 2)

表2　48 h 各组血清生化指标水平及肝组织 FXR mRNA 表达变化（x±s） 注：a 为与对照组比较，P<0.05；b 为与模型组比较，P<0.05。

表 248 h 各组血清生化指标水平及肝组织 FXR mRNA 表达变化（x±s）

表 3(Table 3)

表3　72 h 各组血清生化指标水平及肝组织 FXR mRNA 表达变化（x±s） 注：a 为与对照组比较，P<0.05；b 为与模型组比较，P<0.05。

表 372 h 各组血清生化指标水平及肝组织 FXR mRNA 表达变化（x±s）

造模干预后各时间点，模型组大鼠肝组 织中FXR mRNA水平较对照组显著降低（均 P<0.05），大黄素干预组大鼠肝组织中 FXR mRNA 水平较模型组显著升高（均P<0.05）；除 72 h 外， 大黄素干预组在 24 h 和 48 h FXR mRNA 水平仍低 于对照组（均P<0.05）。见表 1~3。 3　讨论

胆汁淤积是一种临床综合征，常见于 IHS 等 疾病中，若不及时进行有效治疗，将导致肝硬化 等严重后果^[3]。目前临床上治疗胆汁淤积的常用药 物包括 UDCA 和皮质激素^[5]，但其治疗疗效尚不 满意，且 UDCA 起效缓慢，较为昂贵，而皮质激 素具有免疫抑制副作用，使这两种药物的使用受 到很大限制^[15]。因此，探索高效、低毒、价廉的 胆汁淤积治疗药物十分必要。

中药大黄具有增加胆红素排出肠道、减少胆 红素重吸收、促进胆汁分泌、保护肝细胞等作用， 因此，大黄已应用于临床治疗肝内胆汁淤积。但 大黄为中草药复合物，含有多种成分，其作用机 制不易阐明，因此有必要对大黄中的有效单体进 行进一步的研究以明确其作用机制，从而进一步 提高疗效、降低副作用。大黄素是大黄中分离出 来的主要有效单体，研究证实其具有肝保护作用 及抗炎、抗病毒、抑菌、免疫调节、促进胃肠蠕动、 抗氧化、清除自由基、改善微循环等药理作用^{[6, 7, 8, 9, 10]}， 为进一步探讨大黄素治疗淤胆型肝炎的作用及其 机制奠定了基础。前期研究已证实大黄素可通过 抗炎机制发挥对肝细胞的保护效应和对淤胆型肝 炎的治疗作用，这种作用主要是通过拮抗促炎细 胞因子和介质、抑制氧化应激损伤、改善肝脏微 循环、减少损伤信号、抑制中性粒细胞浸润等来 实现的^[11]。本实验在此基础上进一步研究大黄素 对 FXR 的作用，以进一步探讨 FXR 在淤胆型肝炎 中的表达及大黄素的药理作用机制。ANIT 诱发动 物肝损伤的生物化学和病理形态学改变与人肝内 胆汁淤积性肝病相似^{[13, 14]}，常被用来制作淤胆型 肝炎的动物模型，而且 ANIT 在动物体内引起胆汁 淤积是可重复的，并呈剂量依赖性，从1962 年开始， 就被广泛用于诱导肝内胆汁淤积的动物模型^[13]， 本实验通过建立此动物模型进行研究。

FXR 是核受体超家族成员之一，因其可以被 生理水平的法尼醇激活而得名，是一种胆汁酸受 体，在肝脏、胆囊、胃肠道、肾上腺和肾脏均有 高度表达。FXR 由人的常染色体基因编码，具有 核受体的典型结构，即包括氨基末端高度保守的 DNA 结合区（DBD）、配体非依赖性转录激活功 能区（AF-1）、羧基末端配体结合区（LBD）及 配体依赖性功能区（AF-2）。FXR 的配体与 LBD 结合后，使核受体的空间构型发生改变，进而与 视黄醛衍生物受体（RXR）形成异源二聚体，直 接和特定的 DNA 反应元件结合，从而调节基因 的转录。FXR 与胆汁酸结合后调节胆汁酸代谢， 维持胆汁酸稳态。实验证明，FXR 对胆汁酸的 合成、解毒和转运，以及肝纤维化形成等方面均 有作用：FXR 能够通过小异源二聚体伴侣受体 （small heterodimer partner,SHP）抑制胆汁酸的合 成，诱导肝内胆汁酸的解毒效应，诱导小胆管胆 汁酸的排泄，增加胆汁的流动，增加胆汁中磷脂 的含量，通过 SHP 和过氧化物酶体增殖物激活受 体 γ（peroxisome proliferstor activated receptor γ, PPARγ）抑制肝纤维化的形成 ^{[16, 17, 18]} 。使用 FXR 的激动剂，如 GW4064、6-ECDCA 等可以明显降 低雌二醇诱导的胆汁淤积中肝细胞摄取胆盐，并 能恢复胆汁流动，降低血清淤胆指标。因此，核 受体 FXR 目前被认为处于胆汁淤积治疗的枢纽地 位^[19]，FXR 受到激动后，介导多种抑制胆汁淤积 的通路。

本实验结果发现，大黄素可降低淤胆型肝 炎的 ALT、TB、DB、TBA 水平，并可显著减轻 肝组织病理损伤，淤胆型肝炎模型组肝组织中 FXR mRNA 表达显著降低，大黄素则可促进 FXR mRNA 的表达。本研究进一步证实，大黄素的肝 保护作用，除了抗炎机制外，其对淤胆型肝炎的 治疗作用还可通过促进 FXR mRNA 表达来发挥。

本研究初步探讨了大黄素对处于胆汁淤积枢 纽地位的 FXR 的作用，在胆汁酸合成通路中， SHP 介导的抑制通路是 FXR 信号下传的关键分 子，与 FXR 呈配体关系；在胆汁酸解毒通路中， UGT2B4 接受来自于 FXR 的影响，下传 FXR 的解 毒信号；而在胆汁酸转运过程中，BSEP 激动后发 挥胆汁成分的转运作用，主要受到 FXR 的调控。 因此对处于 FXR 下游的其他胆汁淤积相关分子的 改变仍需进一步的研究。