急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病（acute lymphocytic leukemia,ALL）是儿童最常见的肿瘤性疾病，其 治疗的关键在于杀伤肿瘤细胞并使患儿始终处于 缓解状态。6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine,6-MP） 作为维持治疗阶段的主要化疗药物，对 ALL 治 疗 至 关 重 要。 巯 嘌 呤 甲 基 转 移 酶（thiopurine methyltransferase,TPMT）是 6-MP 等巯嘌呤类药物 的重要分解代谢酶，其单核苷酸基因多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP） 可 能 使 该 酶 活 性 降低，继而造成活性代谢产物 6-硫鸟嘌呤核苷酸 （6-thioguanine nucleotides,6-TGNs）浓度升高，药 物毒性增加，最终导致 6-MP 用药存在明显的个体 差异^[1]。就遗传药理学观点而言，ALL 患儿使用 6-MP 前检测 TPMT 基因型可能有利于调整用药剂 量，实现个体化治疗，但临床上关于 TPMT 基因 多态性是否影响个体 6-MP 耐受性尚存争议。本研 究旨在关注 ALL 患儿维持治疗阶段服用 6-MP 后的 不良反应发生情况，探讨中国汉族人群常见的两 个多态性位点（TPMT^*3C、^*1S）基因型 ^[2] 与患儿6-MP 耐受性的关系，以进一步提高 ALL 患儿 6-MP 治疗的安全性。 1　资料与方法 1.1　研究对象及维持治疗方案

选取2006年1月至2012年12月在我院血液 科确诊的 ALL 汉族患儿 46 例为研究对象，其中男 30 例，女 16 例，确诊年龄 5.0±2.8 岁，均严格 按照全国协作组方案^[3] 或广州地区儿童 ALL 2002 化疗协作网方案（改良 ALLIC-BFM-2002 方案） ^[4] 进行治疗并达到以下要求：（1）病历中至少有 3 次有效临床资料；（2）患儿连续口服 6-MP 一个 月以上。全国协作组治疗方案具体为：每晚睡前 以 75 mg/m₂ 剂量顿服6-MP，每周以 20 mg/m₂剂 量肌肉注射甲氨蝶呤，以上连用 3 次后改为长春 新碱 + 地塞米松用 1 周，反复序贯用药至加强治 疗及髓外白血病预防性治疗时停止；改良 ALLICBFM-2002 方案具体为：每晚以 50 mg/m₂剂量空腹 口服 6-MP，每周以 20 mg/m₂剂量口服甲氨蝶呤。 根据患儿临床危险度分型，以上两种方案中如有 需进行鞘内注射的药物（甲氨蝶呤、地塞米松）， 则给药剂量及次数有所差异，化疗总疗程需2~3 年。 1.2　观察指标及评价标准

采用回顾性分析，遇维持治疗结束、复发或 失访时停止。详细记录每位患儿的一般资料（姓名、 性别、出生日期、ALL 临床危险度分型^{[3, 4]}）及每 次入院治疗前的体重、临床症状或体征、实验室 检查结果、6-MP 停用天数及剂量增减情况等作为 不良反应评估的依据。所有患儿均需除外输注血 制品 2 个月内的血常规检查记录；药物不良反应 分级采用美国国立癌症研究所第 3 版常规毒性判 定标准（NCI CTC 3.0）：0 级为未出现药物不良反 应，1~2 级为轻度，3~4 级为重度^{[5, 6]}。对最高级 别毒副反应及评价指标进行统计。 1.3　TPMTcDNA 制备

经监护人知情同意，于初治及输血前抽取 患 儿 骨 髓 液 1.5 mL，EDTA 抗 凝 并 低 温 保 存。 按 QIAamp®RNA Blood Mini Kit 试 剂 盒（ 德 国QIAGEN 公司）说明书操作步骤提取总RNA 30 μL，-80 ℃ 冰 箱 保 存。 取 10 μL 总 RNA，采 用 Reverse Transcriptase XL 逆转录试剂盒（大连 TaKaRa 公司）获取 cDNA，分光光度计检测浓度。 1.4　PCR 扩增

PCR扩增使用的引物沿用本课题组以往 实验所设计的引物序列^[2]，TPMT 扩 增 分 两 步 进 行，第 一 轮 为 PCR 扩 增（PCR-1）： 上 游 5'-GAGAAGTGGCGGAGGTGGAA-3'，下 游 5'-GGAGGCTGAGGCAGGAGAATC-3'，片段长 度 为 1 362 bp。 第 二 轮 为 巢 式 PCR 扩 增（PCR-2），2段扩增片段分别涵盖TPMT^*1S、 ^*3C 突 变位点，每对引物中的1 条5' 端加入GC 夹， 使用 WinMelt TM 2.0 软件行溶解曲线分析以提 高突变检测分辨率；TPMT^*3C（A719G）： 上 游 5'-TGTTCTTTCTTATGATCCAA-3'，下 游 5'-GC 夹-ATTACATTTTCAGGCTTTAG-3'，片段长度 308 bp；TPMT^* 1S：上游 5'-GC 夹-AGGACAAATATTGGCAAA-3'，下 游 5'-GGAACATAAAATGGTGGA-3'，片段长度 222 bp。PCR-1和2分别选用Ex taq 和 taq（大连 TaKaRa 公司），反应体系按说明 书配置，扩增在梯度 PCR 仪（德国 Biometra 公司） 上进行。 1.5　DGGE 筛查及 DNA 测序

采用 DCodeTM 突变检测电泳系统（美国 BioRad 公司）对巢式 DNA 片段行变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分离， 变性梯度范围 30%~60%。上样液为巢式 PCR 产物 及载样液（二甲苯青 FF+ 溴酚蓝，意大利 BBI 公司） 各 25 μL，缓冲液为 1×TAE，60 V 电压下电泳 6 h 后染色拍照并使用Image Lab™3.0 软件分析图像， 筛选异常电泳条带样本送 Invitrogen 公司测序。 1.6　统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行统 计学分析，基因频率采用百分率（%）表示， TPMT^* 1S 各基因型与 6-MP 不良反应发生率比较及 在各临床危险度分型中的分布比较均采用行 × 列 表资料X²检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　临床治疗情况

46 例患儿中，至 2012 年 6 月共完成全疗程化 疗 37 例（80%），包括标危 20 例，中危 13 例， 高危 4 例；复发 7 例（15%），包括标危 2 例，高 危 5 例；失访 2 例（4%），分别发生在维持治疗 的第 183 天和第 247 天。ALL 维持治疗阶段，平 均每例患儿 6-MP 累计治疗时间为 747.2 d（163 ~ 985 d），其中 10 例（22%）因 6-MP 所致的严重 不良反应暂时停药，平均停药总天数为 7.9 d（2~ 22 d），每次停药后经 5.3 d（2~14 d）行升白细胞、 抗感染及保肝等治疗后可继续使用 6-MP 化疗。 2.2　6-MP 所致不良反应发生情况

仅 3 例患儿（7%）对 6-MP 完全耐受，余 43 例患儿（93%）出现的不良反应主要包括：骨髓抑 制（中性粒细胞减少、血小板减少、血红蛋白降 低）、肝脏毒性（转氨酶升高、直接胆红素升高） 及胃肠道反应（黏膜炎 / 口腔炎、呕吐）。结果发 现中性粒细胞减少（93%）、血红蛋白降低（70%）、 血小板减少（50%）、谷丙转氨酶和谷草转氨酶升 高（分别为 83% 和 80%）是较为常见的不良反应， 其中，中性粒细胞减少（61%）在重度不良反应中 多见，余均以轻度不良反应为主，见表 1。

表1(Table 1)

表 1　46 例 ALL 患儿使用 6-MP 致不良反应分级情况　[n=46，例（%）]

表1 46 例 ALL 患儿使用 6-MP 致不良反应分级情况　[n=46，例（%）]

经巢式PCR扩增后的特异性DNA片段经 DGGE 电泳后均成功检测到异常条带，结合测序结 果，TPMT^*3C（A719G，Try240Cys） 各 基 因 型 在 ALL 患儿中的分布频率为：AA 型 44 例（96%）， AG 型 1 例（2%），GG 型 1 例（2%），G 位点等 位基因频率为 3%；TPMT^*1S（T474C，Ile158Ile） 各基因型在 ALL 患儿中的分布频率为：TT 型 37 例（80%），TC 型 7 例（15%），CC 型 2 例（4%）， C 位点等位基因频率为 12%（图1 ~2）。与标危组 相比，TPMT^*1S 各基因型在中、高危组中的分布 差异均无统计学意义（分别X²=1.317、2.890，均 P>0.05）。

图 1　TPMT*3C（A719G）与 TPMT*1S（T474C）DGGE 电泳图　　 1~2、6~8：AA 基因型；3：GG 基因型； 4~5：AG 基因型；9~10、13~14、16：TT 基因型；11：TC 基因型；12、15：CC 基因型。

图 2　TPMT*3C（A719G） 与 TPMT*1S（T474C） 测序结果图　　 左图从上到下依次为： AA 基因型、AG 基因型 和 GG 基因型；右图从上到下依次为：TT 基因型、TC 基因型和 CC 基因型。方框代表突变型等位基因。

ALL 维持治疗期间，2 例（100%）TPMT^*3C 突变基因型（AG+GG）患儿在化疗过程中均发生 以中性粒细胞减少为主的重度骨髓抑制，其中 1 例纯合突变者还出现重度肝脏毒性，经多次中断 化疗后调整 6-MP 用量至原剂量 1/3，维持化疗， 所有不良反应转为轻度。对最高级别评价指标进 行统计，无 TPMT^*3C 突变患儿中，分别有 27 例 （61%）和 15 例（34%）出现重度骨髓抑制和肝 脏毒性，且不良反应在维持治疗期间均可发生， 与6-MP 使用无剂量相关性。此外，TPMT^*1S 各基 因型与 6-MP 所致的重度骨髓抑制及肝脏毒性无明 显相关性（均P>0.05）（表 2）。出现胃肠道反应 的患儿例数较少且大部分为轻度，故未作分析。

表 2(Table 2)

表 2　ALL 患儿 TPMT*1S 基因型与 6-MP 所致不良反应 的关系　[n=46，例（%）]

表 2　ALL 患儿 TPMT*1S 基因型与 6-MP 所致不良反应 的关系　[n=46，例（%）]

6-MP 是最早用于抗肿瘤治疗的嘌呤核苷类似 物，广泛用于儿童 ALL 在内的各种肿瘤疾病治疗。 该药治疗窗狭窄，治疗浓度和中毒浓度接近，对 靶细胞的选择性杀伤能力较弱，因此极易发生患 儿的不耐受现象。本研究回顾性分析了 46 例 ALL 患儿维持治疗期间的不良反应发生情况，结果显 示，除 2 例 ALL 患儿失访外，完成全疗程化疗及复发者分别为 37 例和 7 例，6-MP 所致不良反应 主要表现为骨髓抑制、肝脏毒性以及胃肠道反应， 仅极少部分患儿（7%）对6-MP 完全耐受。国外报道， ALL 维持治疗期间 85% 患儿至少曾经发生一次肝 脏毒性，这与本研究结果一致^[6]。

回顾性分析发现，ALL 维持治疗阶段平均每 例患儿 6-MP 累计治疗时间 747.2 d（163~985 d）， 此期间不良反应常见，但仅 22% 患儿中断 6-MP 化疗。国外报道 ALL 维持化疗 10 周以内有 24.2% 患儿中断 6-MP 化疗，但停药总时间（24.5 d）明 显长于本研究结果（7.9 d）^[6]，分析推测这种差异 可能因为化疗方案及人群体质特征不同而造成， 同时也和临床用药习惯有关。NCI CTC 3.0 作为化 疗药物不良反应常用的评价标准，广泛用于临床 肿瘤药物治疗的安全性监测^{[5, 6]}。本研究中，中性 粒细胞减少（61%）以重度不良反应为主，可能导 致用药后的严重不良后果，或对生命构成潜在威 胁，故必要时应注意调整药物的使用剂量，积极 干预治疗甚至于中断化疗。

代谢酶基因多态性与药物安全性和疗效有关， 课题组前期已对部分 ALL 化疗药物毒副作用与基 因多态性的关系进行探讨并取得了一定成果^[7]。 TPMT 不仅是巯嘌呤类药物的代谢关键酶，也是已 被确定具有基因多态性的最具特征性酶之一，其 基因型及等位基因频率分布具有种族差异性^[8]。目 前已被命名的 TPMT 突变基因型共 30 多种（TPMT^* 1S ~ ^*34） ^[9]，本课题组在前期研究中发现中国汉族 儿童 TPMT 基因编码区仅存在 TPMT^*3C 和 ^*1S 两 个 SNPs，其在健康儿童中的等位基因频率分别为 1.4%（3/222）和 22.5%（50/222） ^[2]。研究发现， 巯嘌呤类药物的活性代谢产物 6-TGNs 不仅是其发 挥治疗作用的重要因素，也可能是引起药物不良 反应而造成治疗中断或失败的主要原因^[10] 。TPMT SNPs 是个体对巯嘌呤类药物耐受程度差异性的遗传基础，与 6-TGNs 浓度有关，可能成为研究该类 药物治疗个体化的关键。 有研究指出，TPMT 低活性患者服用常规剂量 的6-MP 后，不良反应发生率及治疗中断可能性升 高^{[1, 6, 10]}。另一些研究却认为，TPMT 野生型不能减 少不良反应的发生^[11]，同时，出现不良反应的患 者中，仅极少部分存在 TPMT 基因突变^[12]，即对 部分患者而言，6-MP 不耐受与 TPMT 基因型或酶 活性可能无关。这种情况可能与个体合并感染、 同时服用多种药物及肝肾功能差异等影响药物代 谢的因素有关，因此在实际用药过程中还需综合 肝功能、白细胞或中性粒细胞计数等检查结果及 时调整 6-MP 的用药剂量。

本研究已筛查到的 2 例 TPMT^*3C 基因型患儿 均出现严重不良反应，其中 1 例纯和突变患儿出 现明显的 6-MP 剂量相关性不耐受，考虑与该基因 型有关。本研究与国内谢茜等^[13] 研究结果不同， 其原因可能与不良反应的观察时间长短有关，由 于 TPMT^*3C 等位基因频率较低（3%），尚需要扩 大样本量进一步研究。TPMT^*1S 为同义突变，近 年来认为编码区内的同义突变可导致密码子翻译 效率改变而影响蛋白质表达，因此也具有一定的 研究意义。马晓莉等^[14] 认为，该基因型在人群中 的分布极高，但与 6-MP 的耐受性无关。本研究结 果未显示 TPMT^*1S 各基因型与 6-MP 不良反应发生 有相关性，但鉴于 SNP 对药物代谢的影响可能同 时与等位基因的表达丰度有关，有关该基因型对 巯嘌呤药物的作用还有待进一步研究证实。

6-MP 药代动力学及药效动力学存在个体差 异，尽管许多化疗方案均提及需要根据外周血 WBC 计数及分类调整 6-MP 剂量，但这显然不是 确定药物用量的最佳方式。目前与 TPMT 基因多 态性相关的白血病药物治疗个体化研究一直受到 高度关注，而在用药前是否应该进行基因型或酶 活性的检测仍存在争议。最近研究发现，6-MP 等 巯嘌呤类药物在体内的代谢过程复杂，TPMT 野生 基因型患儿服用 6-MP 后出现的不良反应可能还受 巯嘌呤类药物代谢及叶酸代谢过程中的多个关键 酶影响^[15] ，故 TPMT 基因多态性与 ALL 患儿 6-MP 耐受性的关系还有待多中心的协同研究，为 6-MP 的临床个体化用药提供可靠的实验依据。