X-连锁低血磷抗D佝偻病（X-linked hypophosphatemic rickets,XLH）是一组由于肾小管 磷酸盐转运异常和重吸收障碍，导致大量尿磷、 低血磷、骨质矿化缺乏和维生素 D 代谢异常的显 性遗传性疾病^{[1, 2, 3]} 。其发病率为 1/20 000，是遗传 性佝偻病中最常见的一型^{[4, 5]}。本病的临床表现在儿童主要为生长发育迟缓，身材矮小，骨骼疼痛， 行走无力，双下肢弯曲畸形，骨质疏松，多发性 骨折以及牙釉质发育不良^[6]；在成人，主要为软骨 病和骨关节畸形^[7]。实验室检查可发现患者的血磷 明显降低，血钙正常，甲状旁腺激素正常或增高 以及血 1,25-羟维生素 D³正常或轻度下降^[8]。

HYP Consortium 于 1995 年证明磷酸盐调节 基因 （PHEX）为此病的致病基因^[9]。此基因 （OMIM300550）定位于染色体 XP22.1-22.2，全 长 243 kb，由 22 个外显子构成，其编码的跨膜蛋 白含 729 个氨基酸，属于二型锌依赖性内肽酶家 族整合蛋白的成员。研究证实人类和小鼠的 PHEX 序列有 96% 的同源性^[10]。自 1986 年刘向善^[11] 报 道了中国第 1 例低磷抗维生素 D 佝偻病以来，国 内对该病的研究多为病例报道，分子遗传学研究 报道数量较少。本研究报道国内 3 例基因诊断明 确的 XLH，并复习以往相关文献，探讨中国 XLH 患者存在的突变热点和突变类型，以提高对该疾 病的认识。 1　资料与方法 1.1　研究对象

研究对象为我院2011年11月至2012年6月 疑诊为 XLH 的 3 例患儿，其中男 1 例，女 2 例， 年龄 3~9 岁，1 例有家族史（母亲患病），2 例为 散发病例。 1.2　诊断标准

由于国内外对于低磷抗维生素 D 佝偻病没 有严格统一的标准，参考诸福棠实用儿科学^[12]， XLH 的临床特点为：于生后第 1 年出现典型的双 下肢弓形腿，伴身高增长慢，无手足抽搐；在儿 童期，常有颅缝晚闭，四肢大关节可发生致畸性 骨痛关节炎，可有出牙晚，牙痛，牙齿易脱落； 血清钙正常，血清磷明显降低合并尿磷增高（肾 小管磷重吸收率降低），碱性磷酸酶升高，甲状 旁腺功能可正常或轻度升高，双膝放射线检查可 有典型佝偻病改变。回顾性分析了 3 例患儿的临 床资料，患儿均有身材矮小、佝偻病、低磷血症、 尿磷增高等表现，符合 XLH 的临床特点（表 1）。

表1(Table 1)

表 1　12 3 例患儿的临床资料

表1 12 3 例患儿的临床资料

取得患儿监护人知情同意后，留取患儿及其 父母外周静脉血 2 mL（肝素抗凝），用博迈德全 血基因组提取试剂盒提取基因组 DNA，测定浓度 后 -20℃留存备用。 1.4　PCR 扩增

通过 UCSC 数据库（http://genome.ucsc.edu/） 得 到 PHEX 基 因 序 列（NM_000444），应 用 Primer 3.0 设计引物，对 PHEX 基因的 22 个编码 外显子及其相邻的内含子序列进行 PCR 扩增。 在 20 μL 反应体系中，含 10×PCR 缓冲液 2 μL， 2.5 mmol/L 的 dNTP 3 μL，5 U/μL 的 rTaq 酶 0.3 μL 大连宝生物有限公司），100 ng/μL 基因组 DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，去离子水 11.7 μL。PCR 反应条件为：95℃ 预变性 5 min，94℃变性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共 35 个循环， 最后 72℃延伸 5 min。PCR 产物送北京天一辉远公 司切胶纯化和基因测序。 1.5　突变的证实

针对所发现的突变首先进行反向测序，结果 与 UCSC 数据库基因组序列进行比对分析，进一步 检测患儿父母外周血 DNA，了解是否也能发现相 同位点的突变。 2　结果 2.1　临床特点

3 例患儿中，1 例男性患儿以前额突出就诊， 2 例女性患儿以双下肢弯曲就诊。起病年龄为 5 个 月至 2 岁，诊断年龄为 2~3 岁。就诊时患儿身高 均小于 -3 SD，且均有膝内翻、步态不稳和方颅。 肋骨串珠 1 例，肋缘外翻 2 例，牙齿脱落 1 例。 3 例病例血清磷明显降低（0.70~0.86 mmol/L）， 24 h 尿磷明显增高（1.05~1.43 mmol/kg）。血碱性 磷酸酶升高（490~949 U/L）。1 例患儿血甲状旁 腺激素升高（109 pg/mL）。3 例患儿双上肢 + 下 肢 X 片显示符合佝偻病征象（双侧肱骨、尺桡骨、 胫腓骨骨干弯曲，骨质密度减低，干骺端呈杯口状， 毛刷样改变，干骺端发育延迟）（图 1）。病例 3 在 1.5 岁初诊时外院曾误诊为维生素 D 缺乏性佝偻 病，此后手术矫正 O 型腿 3 次。

图 1　病例 1 的影像学表现　　 尺桡骨 X 片显示：骨干弯 曲，骨质密度减低，干骺端呈杯口状，毛刷样改变，干骺端发育 延迟。

将 PHEX 的 22 个编码外显子的测序结果与 正常序列比对，发现 3 例病例均存在基因突变， 包括无义突变和剪接突变 2 种类型。其中已报道 的突变有 2 例：外显子 1 上碱基序列 58 处的胞 嘧啶由胸腺嘧啶代替，从而导致终止密码的产生 （c.58C>T，p.R20X）及在第 15 外显子和内含子 连接处发生单碱基置换（c.1645+1G>A）。新发现 的突变 1 例，为第 4 内含子起始处的剪接位点发 生的改变（c.436+1G>A）。病例 1、3 的父母均未 检测到突变，病例 2 和其母亲均检测相同突变， 其父亲未检测到突变（图 2、3）。

图 2　病例 1、3 的测序结果　　 A：病例 1 测序图，显 示在第15 外显子和内含子连接处发生单碱基置换（c.1645+1G>A）； B: 病例 3 测序图，显示第 4 内含子起始处的剪接位点发生的改变 （c.436+1G>A）。此 2 例突变均为剪接突变。箭头所示为突变位点。

图 3　病例 2 及其母亲的测序结果　　 A：病例 2 测序图， 显示在第 1 外显子上第 58 处的胞嘧啶由胸腺嘧啶代替，从而导致 无义突变（c.58C>T，p.R20X）；B：病例 2 的母亲测序图，显示 在相同位点发现同样突变。箭头所示为突变位点。

至 2014 年 1 月，世界上已报道的 XLH 患者 PHEX 基因突变共有 329 种，覆盖了 PHEX 基因的全长（http://www.phexdb.mcgill.ca/）。其中最常见 的为错义突变（24%），突变热点区域有 3 个：外 显子 8~10，外显子 14~17 和外显子 19~22^[13]。不 同地区的病例总数和突变类型存在差异，欧洲 267 例报道中最常见的突变为框移突变（24%）；美 洲 10 例报道中最常见的为错义突变（40%）；亚 洲 51 例报道中最常见的为无义突变（31%）^[14]。 经 过 检 索 Pubmed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed）和万方（http://www.wanfangdata.com.cn/） 数据库，共检索到 12 篇关于中国 XLH 患者进行 PHEX 基因检测的报道。12 篇文献共报道 89 例 XLH 病人，发现 28 种突变，其中在 22 外显子上 发现的突变数量最多（18%），突变类型最多的 为错义突变（61%）（表 2）。文献曾报道在欧洲 地区 XLH 患者中，散发病例占病人总数的 40%， 而 PHEX 基因突变检出率在有家族史的病人中是 87%，在散发病例中是 73%。中国已报道的 89 例 XLH 病人中，28 例为散发病例，PHEX 基因突变 检出率为 100%，61 例有家族史，PHEX 基因突变 检出率为 88%（54/61）^{[3, 7, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]}。本组资料的3 例 患儿中，1 例有家族史，2 例为散发病例，均检出 PHEX 基因突变。

表 2(Table 2)

表 2　中国人群 PHEX 基因已知突变

表 2　中国人群 PHEX 基因已知突变

病例 2 检出的无义突变（c.58C>T,p.R20X） 位于外显子 1 上，处在 PHEX 编码的跨膜蛋白 N 端的胞质侧，使 mRNA 第 20 位的精氨酸处终止转 录，从而造成蛋白的截短。Dixon 等^[23] 于 1998 年 曾预测大部分（70%）发生在 PHEX 基因上的突 变会导致其蛋白功能的丧失，而并不是由于单倍 剂量不足或者显性负效所导致。迄今为止，世界 上发现此突变的报道共有 7 例，病例人群覆盖的 地域包括了俄罗斯、芬兰、波兰、德国、比利时 和韩国，在中国人群中还未见报道^{[4, 23, 24, 25, 26, 27, 28]}。2000 年 Tyynismaa 等 ^[26] 曾推测此突变没有人种特异性，为 常见的突变之一。在病例 1 和其母亲检测出的剪 接突变（c.1645+1G>A）位于 15 外显子和内含子 的 5’剪接供体位置处。最初于 2001 年在澳大利 亚被报道，迄今共报道 8 例患者^{[2, 29, 30, 31]}。虽然此突 变所导致的 RNA 剪接效应和蛋白功能研究尚不足， 此位点在恒河猴、小鼠、狗等物种中都极度保守， 且此处 5’端的剪接强度根据 Neural Network 剪接 预测软件（www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html）分 析后，发现此处为 G 的剪接强度为 0.96（正常值 0~1），变为 A 后剪接信号极为微弱（<0），且根 据数据分析，此处的突变也可能影响 15 内含子的 3’剪接受体，从而导致外显子跳跃。而病例 3 检 测出的剪接突变（c.436+1G>A）为一例新突变。 在内含子 4 上剪接位点的突变共有 4 例报道，分 别为 c.436+4A>C,c.436+3G>C,c.436+6C>T 和 437-3C>G ^{[29, 32, 33]} 。除了荷兰在 2008 年报道的 c.436+6C>T 从 RNA 水平上证实了此剪接突变导致了外显子 4 的跳跃剪接外，余报道均未做相关功能的研究^[33]。 本研究报道的突变经过 Neural Network 预测后发现 此处 5’端 G 的剪接强度为 0.92，而变为 A 后强 度为 0.1，所以预测此突变会导致错误剪接。 目前，PHEX 基因的基因型和表型没有发现联系^[14]。XLH 患者的临床表现多样，且严重程度 差异很大，主要是靠家族史和临床表现诊断。此 病在儿童期主要表现为生长发育迟缓，包括双下 肢弯曲、出牙延迟和方颅^[6] 。Drezer ^[6]在2000 年分析， XLH 患者的大部分症状在6~12 个月之后才会出现， 而且对于没有家族史的患者，80% 在 2~3 岁以后 因为双下肢弯曲而就诊。在中国已报道的 89 例 病人中，可获取资料的为 42 例，其中小于 18 岁 的 22 例，平均诊断年龄为 6 岁。所有患者就诊原 因均为双腿弯曲，其中有 20 例发现方颅，且起病 平均从 6 个月开始，首发症状均为生长迟缓和方 颅^{[3, 13, 16, 19]}。本组资料中的 3 例患者诊断平均年龄 为 5 岁，均发现方颅。病例 1 从 5 个月开始出现 前额突出，家长未予重视，病例 2 和 3 出现方颅 的时间不详。因此推测 1 岁以内 XLH 的患儿可以 通过方颅等早期佝偻病的体征及时诊断，从而进 行早期治疗。根据文献报道，XLH 病例的骨骼畸 形随年龄增长而逐渐加重，早期及时的诊断和长 期的治疗是决定患者预后的关键^{[6, 34]}。

本研究中，病例 3 曾在 1.5 岁由外院误诊为维 生素 D 缺乏性佝偻病。而国内也有多篇文献分析 了 XLH 患者的误诊，主要被误诊的疾病皆为维生 素 D 缺乏性佝偻病^{[34, 35]}。XLH 是一种以低磷血症 为特征导致骨发育和营养不良的遗传性骨病，有 阳性的家族史，与维生素 D 缺乏性佝偻病相比， 主要特点为：血磷降低显著，尿磷增高，血钙正 常或稍低，罕有抽搐。佝偻病在 2 岁以后仍有活动， 病情持续进展；而后者血磷正常，血钙降低显著， 严重者出现婴儿手足搐搦症。1,25-(OH)D³ 下降明 显。佝偻病在 2 岁后进入后遗症期，没有活动性， 病情不进展。XLH 对于常规剂量维生素 D 和钙剂 治疗无效，本病需磷酸盐合剂和大剂量维生素 D 同时治疗方可有效，以上几点可作为鉴别诊断的 主要方法。另外，佝偻病方面 XLH 还需要和原发 性肾小管酸中毒、范可尼综合征等鉴别。

PHEX 基因作为 XLH 的致病基因，几乎所有 的 PHEX 基因突变均会使 PHEX 在成骨细胞表面 的功能受损。PHEX 在骨骼、牙齿、脑、肌肉、睾 丸中均有表达，但在肾脏中无表达，说明 PHEX 蛋白异常不是直接作用于肾脏来影响磷的回收和 维生素 D 的代谢^[36]。Shimada 等^[37] 和 White 等 ^[38] 多次在实验中证实 FGF-23 作为重要的调磷因子，是 PHEX 蛋白的分解底物。当 XLH 患者基因突变 时，其作用底物堆积，FGF-23 的浓度在患者体内 显著升高，从而影响肾小管对磷的重吸收。2012 年美国内分泌协会将 XLH 与常染色体显性遗传性 低磷性佝偻病（ADHR）、常染色体隐性遗传性佝 偻病（ARHR）、肿瘤诱发的骨软化症（TIO）等 8 种疾病分类于 FGF-23 介导的低磷血症 ^[39]。可以 说 FGF-23 的检测对于 XLH 的患者具有重大意义。 由于技术所限，本研究并未检测患儿体内的 FGF-23 水平，以后应当开展此部分的工作，以对 XLH 进行更加深入的探索。

综上所述，本研究从临床和基因水平上确诊 了 3 例 XLH 病例，此 3 例患儿 PHEX 基因突变在 中国人群中均是首次报道，在国际上其中 2 例为 已报突变，1 例为新突变。另外，本研究还对相 关文献进行了复习和总结，发现中国 XLH 病人在 PHEX 基因报道中最常见的突变位置为第 22 外显 子，最常见的突变类型为错义突变。今后，我们 需要对中国 XLH 的病例进行更大样本的研究，以 明确最常见的突变热点，以及在分子遗传学上面 对基因型和表型的联系进行进一步的探讨。