新生儿坏死性小肠结肠炎（neonatal necrotizing enterocolitis,NEC）是新生儿期常见的严重胃肠道 疾病，多见于极低出生体重儿和早产儿，新生儿 重症监护病房（neonatal intensive care unit,NICU） 内胎龄小于33 周的早产儿NEC 的发病率为5.1%^[1]， 病死率为 15%~30%^[2]。目前对于 NEC 的内科治疗 多是予禁食、胃肠减压、抗感染及支持治疗等， 尚缺乏有效的药物治疗，这也是 NEC 病死率高的 原因之一。白介素-11（interleukin-11,IL-11）与 细胞的生长、分化及凋亡有关，具有刺激造血、 抗细胞凋亡、抗炎和保护黏膜上皮等功能。以往 相关研究发现，应用 IL-11 能减轻多种原因造成 的肠道损伤，促进肠道再生修复^{[3, 4, 5, 6]}。另外，在肠 道发生炎症性疾病时，IL-11 可下调促炎细胞因 子 如 TNF-α、IL-1β 和 IFN-γ的表达^[7]。而重 组人白介素-11（recombinant human interleukin-11, rhIL-11）与天然 IL-11 在体内外的生物学活性无差 异。目前尚未见有关将 IL-11 应用于 NEC 防治的 报道。为此，本研究复制 NEC 的体外模型，采用 MTT 比色法、流式细胞术观察 rhIL-11 对脂多糖 （lipopolysaccharide,LPS）致新生大鼠空肠上皮细 胞系-6（intestinal epithelial cell-6,IEC-6）损伤是 否具有保护作用，为 NEC 防治提供新的思路。 1　材料与方法 1.1　实验材料

IEC-6细胞为美国标准生物品收藏中心 （ATCC）产品；高糖型 DMEM 购自北京钮因华信 科技发展有限公司；胎牛血清购自北京元亨圣马 生物技术研究所；胰蛋白酶（Mediatech 公司）； 脂多糖、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜 （DMSO）为 Sigma 公司产品；rhIL-11 由北京双鹭 药业股份有限公司提供；细胞凋亡检测试剂盒购 自北京宝赛公司；自动酶联检测仪（Bio-Rad 公司）； FACS 流式细胞仪（美国 Becton-Dickinson 公司）。 1.2　细胞培养

IEC-6 细胞接种于含 10% 胎牛血清的高糖型 DMEM 内，并加入含 100 U/mL 的青霉素和链霉素， 置于 37℃、5%CO2培育箱中进行传代培养，取对 数生长期的细胞进行实验。 1.3　NEC 体外模型建立方法

参考文献^{[8, 9]}，并在文献基础上进行改进，予 LPS 处理 IEC-6 细胞建立 NEC 体外模型，LPS 的 最佳作用时间及最佳作用浓度通过预实验选取。 1.4　实验分组

LPS 处理组：待细胞贴壁后加入LPS 建立 NEC体外模型，但不施加rhIL-11；IL-11 治 疗 组：加入 LPS 建立模型后，再加入 100 ng/mL rhIL-11 ^[10]；空白对照组：含等量细胞及培养液，不加入 LPS 及 rhIL-11，予等量生理盐水替代。 1.5　MTT 法检测 IEC-6 细胞增殖活力

收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度为 5~8×10⁴/mL；将 200 μL 的细胞悬液接种于 96 孔 板中，待细胞贴壁后，LPS 处理组和 IL-11 治疗组 内加入 LPS 建立 NEC 体外模型，LPS 作用一段时 间后，IL-11 治疗组加入 100 ng/mL rhIL-11 进行治 疗，空白对照组和 LPS 处理组加入等量生理盐水 替代，置于 37℃、5%CO2培育箱培育；各孔加入 200 μL MTT 溶液，置培养箱培养 4 h；吸去孔内 上清液终止培养；每孔加入 150 μL DMSO，振荡 10 min；用酶标仪在 570 nm 波长下测量各孔吸光 度值。 1.5.1　不同剂量 LPS 作用不同时间对 IEC-6 细胞 增殖活力的影响

通过预实验，选择 LPS 作用 的最佳浓度及最佳时间。依据 LPS 加入剂量，分 为 5、10、50、100 和 200 μg/mL 剂量组，以上不 同剂量LPS 分别作用于IEC-6 细胞 1、3、6、12 和 24 h，MTT 比色法检测比较空白对照组与不同 剂量 LPS 处理组细胞在不同时间点的增殖活力。 各组在不同时间点均取 10 个孔，实验重复 3 次。 1.5.2　rhIL-11 作用时间不同对 IEC-6 细胞增殖活 力的影响

确定LPS 作用的最佳浓度及时间后， IL-11 治疗组加入 100 ng/mL rhIL-11，分别作用 3、 6、9 和 12 h 后进行 MTT 检测，比较空白对照组、 LPS 处理组及 IL-11 治疗组细胞在不同时间点的增 殖活力。各组在不同时间点均取 20 个孔，实验重 复3次。 1.6　流式细胞术检测 IEC-6 细胞凋亡率

采用流式细胞术对各组 IEC-6 细胞凋亡率进 行检测，实验步骤参照试剂盒说明书进行，实验 重复 3 次。 1.7　统计学分析

采用 SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料采用均数 ± 标准差（x±s）表示， 多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采 用 SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　LPS 剂量的选择

预 实 验 时，分 别 加 入 5、10、50、100 和 200 μg/mL LPS 作用 1 h 后，5 μg/mL 和 10 μg/mL 剂 量组 IEC-6 细胞增殖活力与空白对照组比较差异 无统计学意义（均P>0.05），其余剂量组增殖活 力均较空白对照组下降（均P<0.05）；LPS 作用 3 h、6 h 后，各剂量组增殖活力均较空白对照组明 显降低（均P<0.05），尤以 6 h 时差异最为显著； LPS 作用 12 h 后，5、10 和 50 μg/mL 剂量组 IEC-6 细胞的增殖活力恢复，与空白对照组比较差异无 统计学意义，100 μg/mL、200 μg/mL 剂量组 IEC-6 细胞的增殖活力仍与空白对照组存在明显差异（均 P<0.05）；而至 LPS 作用 24 h 时各剂量组 IEC-6 细胞的增殖活力均恢复（均P>0.05）。表明 LPS 可降低 IEC-6 细胞增殖活力，在一定剂量范围内， LPS 剂量越大，对 IEC-6 细胞的增殖活力影响越大， 恢复越慢。

由于该实验后继需加入 rhIL-11 进行治疗，因 此需要选择 LPS 发挥作用时间较长的剂量组，以 便于观察 rhIL-11 的作用，由表 1 结果可知，5、 10 和 50 μg/mL LPS 作用后 IEC-6 细胞增殖活力恢 复较快，LPS 发挥作用时间较短；而 100 μg/mL 及 200 μg/mL 剂量组 LPS 发挥作用时间较长，且两组 在各个时间点细胞的增殖活力无明显差异，因此 选择 100 μg/mL LPS 用于模型复制。

表 1(Table 1)

表1 不同剂量 LPS 对 IEC-6 细胞增殖活力的影响　（x±s）

表 1不同剂量 LPS 对 IEC-6 细胞增殖活力的影响　（x±s）

将 100 μg/mL LPS 作用于 IEC-6 细胞后，比较 空白对照组与 LPS 处理组（100 μg/mL）细胞的增 殖活力。在 LPS 作用 1 h 时，空白对照组细胞增 殖活力高于 LPS 处理组（P=0.003）；而 LPS 作用 3 h、6 h 时，空白对照组细胞增殖活力亦高于 LPS 处理组（P<0.001）。由于 IEC-6 细胞自身增殖能 力强，且该实验后继需加入 rhIL-11，因此 LPS 作 用时间不宜过长，且综合考虑 1、3、6 h IEC-6细 胞增殖活力下降的程度，故选择 100 μg/mL LPS 作 用 3 h 建立体外模型。见表 1。 2.3　rhIL-11 对 LPS 致 IEC-6 细胞增殖活力改变 的影响

100 μg/mL LPS 作用 IEC-6 细胞 3 h 后，IL-11 治疗组加入 100 ng/mL rhIL-11 对 IEC-6 细胞进行治 疗，LPS 处理组和空白对照组未加入 rhIL-11，而 予等量生理盐水替代。在 rhIL-11 治疗 3 h 时，LPS 处理组、IL-11 治疗组细胞的增殖活力均明显低于 空白对照组（均P<0.01），而 LPS 处理组和 IL-11 治疗组之间增殖活力差异无统计学意义（P>0.05）； 在 rhIL-11 治 疗 6 h 后，虽 然 LPS 处 理 组、IL-11 治疗组细胞的增殖活力仍低于空白对照组（均 P<0.01），但 IL-11 组增殖活力有增加的趋势；而 在 rhIL-11 治疗 9 h 后，IL-11 治疗组细胞的增殖 活力增加，与空白对照组比较差异无统计学意义 （P>0.05），而此时 LPS 处理组增殖活力仍明显 低于空白对照组和 IL-11 治疗组（均P<0.05）；在 rhIL-11 加入 12 h 后，各组间 IEC-6 细胞的增殖活 力差异无统计学意义（P>0.05）。表明 rhIL-11 可 促进 LPS 损伤后的 IEC-6 细胞增殖，促进 IEC-6细 胞增殖活力的尽早恢复。见表 2。

表 2(Table 2)

表2 rhIL-11 对 IEC-6 细胞增殖活力的影响　（x±s）

表 2rhIL-11 对 IEC-6 细胞增殖活力的影响　（x±s）

IL-11 治疗组在 100 ng/mL rhIL-11 施加 9 h 后， 其早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率与空白对照 组比较差异均无统计学意义（均P>0.05），却显 著低于 LPS 处理组（均P<0.05）。表明 100 μg/mL LPS 可明显增加 IEC-6 细胞的凋亡和坏死率，而给 予 rhIL-11 治疗可显著降低 IEC-6 细胞的凋亡和坏 死率，因此，rhIL-11 对 LPS 损伤后的 IEC-6 细胞 具有保护作用。见表 3。

表 3(Table 3)

表3 IL-11 治疗 9 h 后各组 IEC-6 细胞凋亡和坏死率比较（x±s，%）

表 3IL-11 治疗 9 h 后各组 IEC-6 细胞凋亡和坏死率比较（x±s，%）

IL-11 是由骨髓基质细胞系分泌的一种多效能 的细胞因子^[11] ，目前国内外有关 IL-11 在 NEC 中 的保护作用及其信号转导机制的研究甚少。国外 研究报道，IL-11 可减轻炎症性肠病的临床症状和 组织学病变^[12] ；在急性 NEC 患儿中，IL-11 mRNA 水平上调，且 IL-11 mRNA 的表达水平与 NEC 的 严重程度呈负相关^[13]；在肠道缺血性坏死及再灌 注损伤时，予 IL-11 预处理后肠上皮细胞凋亡和坏 死明显减少，并可促进细胞增殖再生^{[14, 15]} ；rhIL-11 可促进患有西 - 维氏瘘大鼠的肠上皮再生，减 轻肠道黏膜萎缩，并可减少短肠综合征的发生^[16]。另外，国内研究发现小鼠受中子辐射损伤肠道后， 外源性应用 IL-11 可减轻辐射引起的肠道 IL-11 受 体下调，从而减轻损伤，促进肠道修复^[17]。以上 研究结果均提示，IL-11 在肠道损伤时具有保护作 用。

目前多采用 LPS 建立 NEC 细胞模型^[18]，本实 验予不同浓度 LPS 作用于 IEC-6 细胞，MTT 结果 显示不同浓度 LPS 可在加入后 1 ~24 h 导致 IEC-6 细胞增殖活力降低，剂量越大，增殖活力降低越 明显，但 LPS 剂量超过 100 μg/mL 后，细胞增殖活 力未见明显改变。当予 100 μg/mL LPS 作用 IEC-6 细胞 3 h，LPS 处理组增殖活力明显降低，与空白 对照组存在差异；而 IL-11 治疗组加入 100 ng/mL rhIL-11 治疗 9 h 时，IL-11 治疗组增殖活力与空白 对照组无明显差异，但此时 LPS 处理组细胞增殖 活力仍低于空白对照组和 IL-11 治疗组。提示： rhIL-11 可促进 LPS 致 IEC-6 细胞损伤后增殖活力 恢复。另外，流式细胞术结果显示 100 ng/mL rhIL-11 治疗 9 h 时，LPS 处理组细胞的早期凋亡率及晚 期凋亡率和坏死率较空白对照组和 IL-11 治疗组均 明显增加，而 IL-11 治疗组与空白对照组比较无差 异；虽然 IL-11 治疗组细胞的总凋亡率和坏死率仍 较空白对照组高，但与 LPS 处理组相比，却明显 降低，提示 rhIL-11 可降低 LPS 致 IEC-6 细胞凋亡 和坏死率，在 NEC 时对肠上皮细胞发挥一定的保 护作用。

但值得指出的是，在 rhIL-11 作用 12 h 后， MTT 显示各组间增殖活力无差异，考虑 IEC-6细 胞为正常SD 大鼠空肠隐窝分离培养的上皮细胞系, 其增殖能力及自我修复能力强，且流式细胞术结 果提示 LPS 导致细胞凋亡主要在早期，故考虑原 因为：模型建立后，LPS 损伤较轻的 IEC-6 细胞在 后期迅速修复及增殖所致。

目前关于IL-11 对NEC 的保护机制尚不清楚。有研究报道 IL-11 可能通过下调 TNF-α等NEC发 病过程中重要的促炎细胞因子的表达，抑制盲肠 髓过氧化物酶的活性，而发挥抗炎作用^[19]。另外， IL-11 可下调细胞凋亡蛋白酶的表达，而细胞凋亡 蛋白酶在细胞凋亡启动方面起着关键性的作用。 IL-11 在 NEC 发病过程中究竟如何发挥保护作用尚 待进一步的研究。

综上所述，本研究显示在 LPS 致 IEC-6 细胞 损伤时，rhIL-11 可通过促进细胞增殖、抑制其凋 亡的作用，减轻损伤，促进肠上皮细胞恢复正常， 从而为该病的治疗提供新的思路，对临床应用 rhIL-11 治疗 NEC 提供了一定的理论依据。