全球每年 120 万儿童死于急性呼吸道感染， 大多发生在发展中国家^[1]。WHO 报道呼吸道感染 为 5 岁以下儿童死因的前三位之一^[2]。冯江等^[3] 也报道了呼吸道感染为中国 5 岁以下儿童死亡的 前三位死因之一，且以呼吸道合胞病毒（RSV）为 首的病毒为急性呼吸道感染的主要病原。越来越 多的流行病学研究表明人偏肺病毒（HMPV）是仅 次于 RSV 的重要呼吸道感染病原。HMPV 感染主 要发生在 3 岁以内婴幼儿，特别是 1 岁以内婴儿^[4]。 HMPV 感染可致重症肺炎甚至呼吸衰竭，免疫低 下人群、儿童和老人等更容易发生^[5] 。目前 HMPV 感染机制尚不完全清楚，临床治疗无针对性。全 世界尚无 HMPV 疫苗进入临床使用，处于临床前 研究的灭活疫苗、亚单位疫苗、重组减毒活疫苗 等均具有诱导炎症、免疫原性不足、制备困难等 弱点，临床应用前景堪忧。因此，HMPV 感染机 制的研究和疫苗开发十分必要。 1　HMPV 感染流行情况

HMPV 于2001 年首次被分离，属副粘病毒 科偏肺病毒属。目前世界各地相继报道该病毒感 染流行，赵晓东等于 2004 年在国内首次分离了 HMPV。利用 HMPV 中国流行毒株感染 Vero-E6 细 胞裂解液为抗原，检测重庆地区 0~6 岁儿童血清 中 HMPV IgG 水平，结果发现儿童至 6 岁时几乎 100％均已感染过HMPV^[6]，与 Ebihara 等^[7] 国外 报道一致。本课题组对重庆地区儿童 HMPV 感染 进行了连续五年的分子流行病学研究，发现该病 毒感染在冬春季呈现高峰，在因急性呼吸道感染 住院患儿中的检出率可高达 14.6%~35.8%；HMPV 感染无明显性别差异，但感染年龄以婴幼儿最为 常见；在急性呼吸道感染的患儿中，6 个月以内 HMPV 感 染 者 可 高 达 10%~27.8%，6 个 月 ~2 岁 为 5.1%~8.2%，2~6 岁 为 4.5% 左 右，>6 岁 则 仅 为 0.2%~1.9%^{[4, 8, 9]}，上述流行病学特点与全球其他 地区的研究结果相似^{[10, 11, 12]}。国内的一项研究报道 北京的急性呼吸道感染的成年人中 1.7% 有 HMPV 感染^[13]，而台湾曾报道了一次 HMPV 在成人中的 爆发流行，13 个成年人中 10 人检出单纯 HMPV 感染，且有 1 例因呼吸衰竭致死^[14]。HMPV 基于 基因型可分为 A、B 两型，又可进一步分为 A1、 A2、B1、B2 四个亚型，在 2007~2011 年间，重庆 地区 HMPV 流行株主要为 A2b 亚型，国内其他地 区也主要以 A2b 亚型为主^{[9, 15]}，仅金玉等^[16] 报道 2009~2010 年南京地区以 B1 亚型流行为主。东亚、 欧美及中东一些国家的研究也显示 HMPV 感染以 A2 亚型为主，其中 A2a，A2b 亚型均可为主导流 行，但更多以 A2b 亚型感染为主，其次为 B2 亚型， 而 A1 和 B1 亚型流行相对少见^{[12, 17, 18, 19, 20, 21, 22]}。基于 A2 亚 型的长期流行，Li 等^[23] 从进化动力学方面分析了 A2b 亚型的流行，并发现 A2 亚型基因相对其他亚 型有最大的平均基因距离及第二高的等位基因互 换率，因而进化速度更快，且遗传多样性水平高 于其他亚型，有更强的生存能力，解释了 A2 亚型 的长期流行。

HMPV 可致上、下呼吸道感染，甚至重症肺 炎，临床表现与 RSV 感染相似，表现为咳嗽、喘 息、发热、紫绀等，其中 30%~40% 患儿出现发热 症状，70%~80% 患儿出现喘息症状，诊断支气管 肺炎及毛细支气管炎最为常见，国外的一项研究 显示HMPV A亚型感染致病更多地被诊断为肺炎， 而 B 亚型感染则更多地与毛细支气管炎发病联系 密切^[21]。HMPV 与 RSV 合并感染时临床症状会加 重，特别是发生呼吸衰竭的风险更高^[4]。同时本课 题组发现 HMPV 感染与喘息性疾病相关，机制尚 不明了，可能是与 HMPV 感染导致的气道高反应 性相关^{[5, 24]}。 2　HMPV 与包膜融合

HMPV基因3'→5'的序列为N-P-M-F-M2-SHG-L，编码 9 种蛋白，其中 F、G 和 SH 是跨膜表 面蛋白，N、P、L 共同形成核衣壳蛋白。现已知， HMPV 采用病毒宿主细胞膜融合机制进入宿主细 胞，其中 F 蛋白、G 蛋白是肺病毒亚科所有成员 均具有的膜糖蛋白分子，主要介导病毒粘附靶细 胞、病毒与细胞膜融合过程。与 RSV 膜融合过程 不同的是，有研究报道重组的缺乏 G 蛋白、SH 蛋 白的HMPV在细胞培养液中的复制水平不受影响， 而 G 蛋白反而可能对 HMPV F 蛋白介导的融合过 程有抑制作用^{[25, 26]}，这种现象提示 F 蛋白能单独 介导膜融合过程。这种差异可能与 RSV F 蛋白缺 乏 HMPV F 蛋 白 特 有 的 Arg-Gly-Asp（RGD） 序 列有关。RGD 序列与宿主细胞表面的整合素特别 是 αvβ1 整合素结合促进病毒与宿主细胞粘附过 程^[27]。HMPV 感染时，病毒产生无活性前体蛋白 （F0），需在蛋白酶作用下裂解成两个由二硫键 相连的有膜融合活性的多肽 F1 和 F2，而 HMPV F 蛋白介导的膜融合过程需要在低 pH 环境下进 行^{[5, 28]}，F 基因外功能区的组氨酸残基对于 F 蛋白 的功能有很大影响，将组氨酸残基突变后，降低 了其促进细胞融合的作用^[28]。Chang 等^[29] 研究显 示 HRB 连接区域的 H435 残基扮演 pH 感应器的角 色，当在低 pH 环境中时，H435 与周围区域的静 电排斥作用促进 F 蛋白介导膜融合过程。另有研 究显示人肺的上皮细胞中表达的 MPRSS2（一种跨 膜丝氨酸蛋白酶）可以有效的促进F 蛋白裂解过程， 为偏肺病毒的感染、复制提供了有利条件^[30]。 3　HMPV 感染免疫机制

病毒感染后肺部病变的严重程度取决于两方 面：病毒复制及宿主对外来病原的免疫应答^[31]。 而目前越来越多的证据表明，在病毒感染的发病 机制中，机体的免疫应答在肺部炎症中的作用比 病毒复制本身更大。 3.1　HMPV 感染的固有免疫应答

固有免疫系统是抵抗病毒入侵的第一道防线， 在抗病毒免疫应答中，固有免疫的启动具有重要 的作用，其不仅是感染清除和进展的主要决定因 素，还影响后续适应性免疫的产生，并在两种不 同的免疫功能之间起十分关键的桥梁作用。其主 要功能为免疫识别和诱导炎症应答产生，通过单 核 / 巨噬细胞及树突状细胞等固有免疫细胞表面或 者胞内的模式识别受体（PRRs）识别病原体相关 模式分子（PAMPs），从而诱导细胞产生大量细 胞因子、趋化因子、低分子介质等，起到炎症和 免疫调节作用。PRRs 目前分为Toll 样受体（TLRs）、 维甲酸诱导基因样受体（RLRs）和核苷酸结合寡 聚化结构域蛋白（NLRs），其中在病毒感染中研 究较多的是 TLRs。

TLRs 为 I 型跨膜蛋白，通过识别细菌、病毒 和环境中相应抗原的保守结构，启动天然免疫和 调节性免疫应答^{[32, 33]}，对于 TLRs 在呼吸道病毒感 染中的作用，大量的研究发现 TLR3 可识别多种 病毒 dsRNA，TLR4 与 RSV F 蛋白结合，TLR7~8 可识别流感等病毒的ssRNA^{[34, 35, 36]}，而 TLR2 可与 麻疹病毒 HA 结合^[37]。既往本课题组在 hMPV 感 染体外培养的人肺上皮细胞株 A549 细胞中发现 , HMPV 感染后 TLR3~4、TLR7~9 的表达明显增高， 同时伴 IFN-α 及 TNF-α 的表达增加 ,在小鼠模型 中也有相似发现^{[38, 39]}，说明多条 TLRs 信号通路的 激活，可能是 HMPV 引发 IRF-3和NF-κB 过度激 活，致使上皮细胞释放大量炎症因子导致气道炎 症的原因。

目前TLR3 在RSV 感染机制的研究已相对 比较成熟，TLR3 特异识别病毒复制的中间产 物 ds-RNA，依赖非 MyD88 途径，通过接头分子 TRIF 介导下游信号转导，诱导 I 型干扰素分泌及 NF-κB 激活^[5]。在 RSV 感染的动物模型和人呼吸 道上皮中发现 TLR3 表达增加，且诱导增强趋化 因子的产生^[40]；而当 RSV 感染 TLR3 基因敲除小 鼠后，呼吸道粘液渗出增多，机体病毒的清除能 力下降，gob5 mRNA、IL-13 和 IL-5 等细胞因子产 生增加，而这些细胞因子发现与哮喘有关^[41]。本 课题组发现 HMPV 感染小鼠模型和 A549 细胞后 TLR3 表达上调，用 TLR3 受体激动剂 PolyI:C 预处 理小鼠后再感染 HMPV，对照单纯 HMPV 感染， 发 现 polyI:C 可 通 过 早 期 活 化 TLR3 抑 制 HMPV 在小鼠肺内的复制，并减轻肺部炎症^{[39, 42]}。综合 而言，TLR3 在 HMPV 感染中起着重要作用，且 TLR3 受体激动剂是一个潜在的治疗 HMPV 感染的 手段。TLR4 除了可以依赖 MyD88 途径外，还可以 同 TLR3 一样通过 TRIF 介导下游信号转导，导致 NF-κB 激活和 I 型干扰素分泌。HMPV 感染 TLR4 基因敲除小鼠后，HMPV 诱导的细胞因子、趋化 因子、I 型干扰素分泌水平明显下降^[31]，小鼠的 临床症状缓解，可能与炎症因子减少降低了气道 高反应性有关。TLR7~9 可通过 MyD88 途径诱导 NF-κB 激活，并且通过 TRAF3 通路激活干扰素 调节因子 7（IRF7）诱导 I 型干扰素的分泌^[5]。本 课题组在对 HMPV 感染小鼠研究中发现，HMPV 感染后 TLR7~8 增高最为显著^[39]，提示在小鼠抗 HMPV 感染的免疫应答中，TLR7/8 通路的激活可 能起着较为重要的作用，其原因还有待进一步的 研究。 3.2　HMPV 感染的适应性免疫应答

呼吸道病毒感染诱导产生的特异性体液和细 胞免疫应答在感染后期非常重要，病毒蛋白特异 性抗体多数情况下与病情恢复相关，高滴度的中 和性抗体可预防相应病毒的感染，但病毒的最终 清除则须由细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）完成。这 两方面互相配合，使机体在感染后 2~4 周内清除 病毒并建立持久或暂时的免疫记忆。

F、G 和 SH 蛋白是 HMPV 的抗原性蛋白，其 中 F 蛋白与机体免疫系统接触最为频繁。在对所 有蛋白质基因序列的分析中发现 F 基因核苷酸序 列具有高度保守性，A、B 两株同源性可达 95%。 Skiadopoulos 等^[33] 评 价 HMPV SH、G 和 F 糖 蛋 白的免疫原性，发现 F 蛋白诱导了高水平的血清 HMPV 中和抗体，并能适度抵抗攻击的 HMPV 的 复制，而 G 和 SH 蛋白仅有微弱的免疫原性和保护 性，同时发现HMPV F 蛋白诱导产生交叉反应性的、保护性抗体，防止不同抗原亚型的病毒感染。

国内有研究观察了 HMPV 感染患儿免疫功能 变 化，发 现 CD3⁺ 、CD4⁺CD25⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD19⁺CD23⁺细胞数量有显著上升，而 NK 细胞无 显著变化甚至有下降，提示 HMPV 感染后引起体 液免疫及细胞免疫发生^{[34, 35]}。在初次 HMPV 感染 的小鼠模型中，研究发现 CD4+ 和 CD8+T 细胞协同 发挥较强的抗病毒作用，其中 CD4+T 细胞介导调 控炎症因子的产生占主导作用，比如 IL-6，IL-1， TNF 等^[36]；同时发现了不正常的适应性免疫反应， 比如，HMPV 感染小鼠后由 CTL 产生 Th2 细胞因 子IL-4、IL-10 表达增加，同时伴低水平IFN-γ表达， 但该 CTL 反应有延迟，相反，用 CTL 表位疫苗免 疫小鼠后诱导 Th1 细胞因子 IL-12 和 IFN-γ 明显 增强，局部形成 Th1 优势环境，并证实在小鼠模 型中 CTL 表位疫苗在控制 HMPV 感染上的有效性； 同时在 CTL 反应延迟阶段被动给予 HMPV 抗体可 能有保护作用^{[39, 43]}。上述研究表明同 RSV 感染相 似，Th1/Th2 失衡，特别是 Th2 类细胞因子占优势 是 HMPV 致病的机制之一。 4　国内外疫苗研究现状

目前处于临床前研究的 HMPV 疫苗有灭活 疫苗、亚单位疫苗、重组减毒活疫苗等。灭活的 HMPV 疫苗攻毒时诱导 Th2 反应增强以及严重的 肺部组织病理损伤，证实上述灭活疫苗不可能应 用于尚未感染过的婴幼儿^{[44, 45]}。在非洲绿猴肺内， 缺失 SH 的重组偏肺病毒复制能力较野生型病毒轻 微下降，缺失 G 或 M2-2 基因的重组病毒在上下呼 吸道的复制能力则分别下降 6、160 倍及 3 200、 4 000 倍；再次攻毒时，上气道仅能检测到微量病 毒复制，下气道则完全没有病毒复制，且都能诱 导较高水平的 HMPV 血清中和抗体^[25]。Talaat 等^[46] 将修饰 HMPV SH 基因得到的毒性减弱的 rHMPVSHs 感染 21 个健康成年人，这项临床试验证实 rHMPV-SHs 有一定感染力且能有不错免疫原性， 21 例参与者中未发现严重副反应。RSV F 蛋白亚 单位疫苗应用在已感染过的儿童或者成人中证明 具有较好的免疫原性和安全性^{[47, 48]}，而动物模型 的结果提示该类型疫苗应用在未感染过的儿童可 能出现肺病理损害加重的风险^[49]，考虑 HMPV 和 RSV 密切的遗传相关性，HMPV F 单位亚单位疫苗 应用于未感染过的婴幼儿可能有肺病理损害增强 的风险，而可能更适合运用于成人或者已感染过 HMPV 的儿童 ^[50]。 5　本课题组重组 HMPV 疫苗研究

减毒活疫苗模拟自然感染，不仅具有良好的 免疫原性，在尚未感染过 HMPV 的婴幼儿中没有 导致疫苗增强免疫病理应答的风险，因而被认为 是目前最佳的初种 HMPV 疫苗^{[51, 52, 53]}。反向遗传学 方法为减毒活疫苗的制备提供了条件，可在 cDNA 水平对病毒基因组进行改建，去除某一个病毒蛋 白质基因，制备基因缺失型变异株，明显降低其 毒力。

糖基化作为一种主要翻译后修饰对蛋白质功 能有重要影响，主要表现在蛋白质折叠、运输、 定位方面。与 Schowalter 等^[26] 的研究一样，本课 题组成功预测了 HMPV F 蛋白的糖基化和磷酸化 位点，发现 HMPV 4 标准株均在 F 蛋白氨基酸序 列 3 个相同位点（第 57、172、353 位）存在可能 的N-连接糖基化位点；另外本课题组用 Western Blot 分析该 3 个位点突变株与野生株（WT 株）F1 的表达进一步证实第 57、172、353 位点为可能的 糖基化位点^{[5, 54]}。

本课题组以已获得的GFP标记的HMPV NL/1/00（WT 株）全长 cDNA 质粒为模板，通过体 外定点突变已知的 3 个 N-连接糖基化位点，得到 突变病毒株 M1（第 57 位点突变），M2（第 172 位点突变），M3（第 353 位点突变），M4（第 57+172 位点突变），M5（第 172+353 位点突变）， M6（第 57+353 位点突变），M7（第 57+172+353 位点突变）；利用反向遗传技术成功获得重组突 变株 M1、M2、M4，而 M3、M5、M6、M7 经多次 拯救均未成功，未拯救成功的 4 个突变株均包含 第 353 位点的突变，提示正常的第 353 位点对病 毒生长是必须的前提^[54]。同时本课题组用流式细 胞术检测发现 M1、M2、M4 株 F 蛋白在被感染细胞细胞膜上的表达水平同 WT 株比较无明显差异， 提示突变株 F 蛋白的折叠、表达正确^[54]。

从病毒体外复制能力学方面，利用本课题组 已成功建立的空班形成法^[55] 检测 WT 和突变株病 毒感染 Vero E6 细胞后的病毒滴度，结果提示突变 株和 WT 株病毒滴度均在感染后第 4 天达到顶峰， 其中 M1 株和 WT 株峰值滴度水平相近，可达到 10⁵pfu/mL 水平，而 M2 和 M4 株峰值滴度只能达 到 104pfu/mL 水平。同时应用体外竞争复制试验分 析突变株的复制能力，M1 株与 WT 等比例混合， M2、M4 株 分 别 与 WT 株 以 1 : 1，10 : 1，100 : 1， 1 000 : 1 混合感染 Vero E6，结果显示 M1 株与 WT 等比例混合时，M1 在感染后第 15 天从混合群体 中消失。M2 株在与 WT 株 1 : 1 比例混合时，M2 株在感染后第 1 天在混合体中消失；以 10 : 1 比例 混合时，M2 株在感染后第 8 天消失，继续传代 5 代仍检测不到M2 信号；以100 : 1 或1 000 : 1 混合时， 在感染后 4 d 内仅检测到持续 M2 存在的信号。M4 株在与WT株1 : 1 比例混合时，M4 株在感染后第 1 天在混合体中消失；以 10 : 1 比例混合时，M4 株 在感染后第 5 天消失；以 100 : 1 比例混合时，M4 株在感染后第 8 天在混合体中消失；以 1 000 : 1比 例混合时，感染后 5 d 内 M4 信号为主要信号。体 外模型提示较 WT 株体外复制能力相比，M1 株轻 度下降，M2、M4 株明显下降，但 M2 株强于 M4 株^[54]。

从病毒体内复制能力方面，WT 在感染 BALB/c 小鼠后 5 d 复制水平可达 105pfu/g，M1 株肺内复 制水平较 WT 稍低；M4 株感染小鼠后，仅少数小 鼠于感染后 3 d 肺内检出病毒，M2 株则在感染后 各时间点均未能检出病毒。采用 SCID 小鼠模型， 结果显示 WT 和 M1 株在 SCID 小鼠肺内均能复制 至高水平；M2 株和 M4 株则与在免疫功能正常鼠 肺内有所不同，维持低水平复制^[56]。本课题组也 观察到 WT 株和突变株感染小鼠后，小鼠肺组织病 理改变均为典型的间质性肺炎表现，但 M2 和 M4 株感染后肺组织病理评分明显低于 M1 株和 WT 株 感染后，但高于正常对照组^[54]。同时本课题组研 究发现 M2 不仅能诱导小鼠产生与野生型病毒几乎 同一水平的中和抗体，而且在接种后 8 周能完全 保护小鼠免于同型病毒感染，部分交叉保护免于 异型病毒感染。 6　总结

人偏肺病毒为儿童呼吸道感染的重要常见病 原，成为影响儿童期健康的重要威胁，但目前该 病毒感染机制尚不完全明了，且尚无有效疫苗。 本课题组发现 F 蛋白是 HMPV 主要的抗原蛋白， 具有高免疫原性和保护作用，且能单独介导膜融 合过程，本课题组着眼于 F 蛋白，通过体外定点 突变 F 蛋白基因第 57 位，第 172 位，第 353 位及 反向遗传技术开发出重组人类偏肺疫苗（专利号： 201010106676），并已用动物实验证实 F 蛋白去 N 连接糖链可致 HMPV 不同程度减毒，且由于仅 有 1 条糖链的差异，最大限度保存了 HMPV 的免 疫原性，有效解决了减毒与免疫原性这一对减毒 活疫苗制备过程中最主要的矛盾。由于 M2 株体外 复制能力优于 M4 株体，因而 M2 株被确定为疫苗 候选株，也是国内外唯一采用单核苷酸变异致病 毒减毒的疫苗候选株。为远期开发用于临床，很 有必要进行灵长类动物实验，进一步证实 M2 免疫 保护效果和安全性，同时要评估 M2 株遗传稳定性， 除外 F 基因第 172 位氨基酸发生回复突变恢复毒 力的可能性。同时达到免疫效力和疫苗安全性这 对矛盾的最佳平衡也是本疫苗研究的难点。