急性髓系白血病（AML）是一组起源于造血 干细胞的恶性克隆性疾病，由基因突变导致的细 胞增殖、分化及凋亡途径改变是AML 的发病基础。 目前国际上依据初诊时的白细胞计数、年龄、细 胞遗传学（染色体核型分析）检测结果等将其分 为预后良好、预后中等及预后差3 组^[1]。

SIRT1（silent mating-type information regulation 2 homologue 1）是Sirtuins 去乙酰化酶家族中的一 员，参与了众多基因转录、能量代谢以及细胞衰 老过程的调节。目前的研究表明，SIRT1 与肿瘤的 发生发展有至关重要的作用。部分研究显示SIRT1 在许多鼠以及人类肿瘤细胞中高表达，下调SIRT1 的表达可引起相应肿瘤细胞的生长停止及凋亡^{[2, 3]}。 也有研究表明，SIRT1 在许多肿瘤中的表达水平是 降低的，在一定程度上抑制了肿瘤发生^[4]。

关于SIRT1 在白血病领域的研究目前仍处于 探索当中。研究显示：SIRT1 低表达于正常成人造 血干/ 祖细胞，但是在慢性粒细胞白血病造血干/ 祖细胞中的表达却是升高的^[5]。SIRT1 的活化可以 被bcr/abe 酪氨酸激酶介导也可独立发生。SIRT1 的活化促进慢性髓系白血病（CML）干细胞对酪 氨酸激酶抑制因子拮抗，从而起到了后天获得的 类似bcr/abe 突变的拮抗作用^[5]。Bradbury 等^[6] 首 先发现SIRT1 在AML 病人中表达升高。而关于 SIRT1 在AML 中的表达情况及对预后的影响目前 鲜有报道。本课题组前期研究发现除目前常见的 染色体异常会影响AML 患儿的预后外，一些尚未 被列为诊断或分型标准的基因异常，如FLT3/TKD 突变等也是儿童AML 致病及预后的关键因素^[7]。 那么SIRTl 在儿童AML 的致病及预后中又扮演了 什么样的角色呢？为了解儿童AML 中SIRT1 的表 达情况，本研究对54 例初诊AML 患儿骨髓活检 组织中SIRTl 的表达情况进行检测，并分析其与临 床特征、疗效的相关性，报告如下。 1　资料与方法 1.1　一般资料

选取2009 年7 月至2012 年4 月于中国医学 科学院血液病医院儿童血液病诊疗中心初诊并行 骨髓活检的54 例AML 患儿为研究对象，所有患 儿均经骨髓形态学、细胞组织化学染色、细胞免 疫分型、分子生物学等确诊。其中男30 例，女24 例，年龄9.5 岁（2~18 岁）。该研究已取得患儿 监护人知情同意。 1.2　诊断、危险度分组及疗效标准

参照1987 年全国白血病化疗讨论会制定的 白血病诊断标准^[8] 并依据AML-99 方案改良的 CAMS-2009 方案^[9] 分型标准对患儿进行危险度分 型。（1）低危组：伴t(8;21) 且WBC<50×10⁹/L， 伴inv16(p13q22)，或年龄<2 岁且无高危因素； （2）高危组：诱导治疗1 疗程未达完全缓解（CR） 或伴-7,5q-、t(16;21)、t(9;22) 等；（3） 中危组： 无上述两组特征的患儿。疗效判断标准参照《血 液病诊断和疗效标准》第3 版^[10]。 1.3　治疗方案

所有进行治疗的非AML-M3 患儿均采用根据 AML-99 方案改良的CAMS-2009 方案^[9] 进行治疗。 A 方案：依托泊甙（VP-16）、阿糖胞苷（Ara-C） 和米托蒽醌（MTZ）组成单诱导方案，第6 天三 联鞘注；B 方案：VP-16、Ara-C 和去甲氧柔红霉 素（IDA）组成的双诱导方案，第4 天三联鞘注； C 方案：VP-16、Ara-C 和IDA 组成的方案，第1 天三联鞘注。其中年龄<2 岁或WBC<100×10⁹/L 的患儿采用A 方案；年龄>2 岁且WBC>100×10⁹/ L 的患儿采用B 方案；1 疗程治疗后骨髓象呈M3 状态的患儿则进行C 方案再诱导治疗。巩固治疗 方案为4~6 个含中、大剂量Ara-C 组成的方案。

所有进行治疗的AML-M3 患儿均采用如下方 案：诱导治疗应用全反式维甲酸（ATRA）或三氧 化二砷（As2O3）或二者联合应用，达CR 后给予 至少２疗程强化治疗，化疗方案为DA（柔红霉素 +Ara-C） 或MA（MTZ+Ara-C）或HA（高三尖杉 酯碱+Ara-C），维持治疗采用全反式维甲酸（ATRA） 联合６- 巯基嘌呤（6-MP）和甲氨蝶呤（MTX）， 缓解期行腰穿加三联鞘注^[11]。 1.4　免疫组化法检测骨髓组织SIRT1 蛋白表达

采用EnVision 两步法进行免疫组化检测^[12]。 兔抗人SIRT1 抗体（ 克隆号E104） 购于美国 Abcam 公司，工作浓度1 : 100；二抗快捷型酶标羊 抗属/ 兔IgG 聚合物购于福州迈新公司。DBA 显色 剂购于北京中山金桥公司。石蜡标本4 μm 厚度 连续切片，高压抗原修复，DBA 显色。用已知阳 性切片作为阳性对照，PBS 代替一抗作为阴性对照。

SIRT1 蛋白定位于细胞核，阳性着色细胞核 呈黄色或棕黄色。每例患儿骨髓组织标本随机选 取2 张切片，每张切片随机观察10 个高倍视野， 在无背景着色条件下用半定量积分法判断结果^[13]： （1）黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分； （2）计数10 个高倍视野，阳性细胞在同类细胞 中所占百分率<25% 为0 分，25%~ 为1 分，50%~ 为2 分，≥ 75% 为3 分。（3）按照上述两项指标 的分数乘积：0 分为阴性，1~3 分为弱阳性，4~6 分为阳性，7~9 分为强阳性。 1.5　分组

根据患儿骨髓活检组织中SIRT1 蛋白的表达 情况将病例分为SIRT1 阴性组（10 例）和SIRT1 阳性组（44 例）；根据SIRT1 表达的阳性程度不 同进一步将SIRT1 阳性组分为（+）组、（2+）组 和（3+）组。各组患儿性别、年龄、FAB 分型、 初诊白细胞计数、骨髓初诊幼稚细胞比例、融合基 因、染色体等分布上差异均无统计学意义，见表 1 。

表 1(Table 1)

表 1 　54 例患儿初诊时基本临床资料

表 1 例患儿初诊时基本临床资料

采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学 分析。符合正态分布的计量资料以均数± 标准差 （x±s）表示，组间比较采用t 检验；非正态分 布的计量资料以中位数（四分位间距）[M（P25, P75）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料用 例（%）表示，采用卡方检验比较组间差异。生存 曲线采用Kaplan-Meier 分析，多因素分析采用Cox 回归分析，P<0.05 为差异有统计学意义。总生存 （OS）期指自诊断到死亡或末次随访日期。无事 件生存（EFS）期定义为自诊断到第1 次事故（包 括复发、在CR 期间的死亡，未达CR 者EFS 为0） 或末次随访日期。随访时间截至2013 年6 月31 日。 2　结果 2.1　各组患儿SIRT1 表达的比较

病理组织骨髓活检显示，SIRTI 阴性组所有有 核细胞均未着色；SIRTI 阳性（+）组、（2+）组和（3+） 组细胞胞核均染色成黄棕色，着色深度由黄棕色 至棕褐色依次加深，着色细胞比例由少至多。见 图 1。

图 1

图 1 SIRT1 骨髓活检病理组织免疫组织化学染色 （×400，DBA 显色）A：SIRTI 阴性组，有核细胞均未着色； B~D 为SIRTI 阳性组，其中B 为（+）组，C 为（2+）组，D 为（3+）组。（+） 组阳性细胞胞核染色成棕色；（2+）组阳性细胞胞核染色为棕色， 每个高倍镜视野着色细胞比例高于（+）组；（3+）组阳性细胞胞 核染色成棕黑色，每个高倍镜视野着色细胞比例高于（2+）组。 箭头所指为SIRT1 阳性细胞。

54 例患儿中有10 例失访，44 例可评价，总 缓解率为75%（33/44），复发率为21%（7/33）， 病死率为32%（14/44）。SIRT1 阴性组10 例患儿中， 2 例失访，8 例可评价，缓解率为87%（7/8），复 发率和病死率均为0。SIRT1 阳性组44 例患儿中， 9 例失访，35 例可评价，缓解率为71%（25/35）， 复发率为28%（7/25），病死率为37%（13/35）。 （+）组8 例患儿中，无失访，缓解率为87%（7/8）， 复发率为14%（1/7），病死率为12%（1/8）； （2+）组7 例患儿中，1 例失访，6 例可评价，缓 解率为83%（5/6），复发率为60%（3/5），病死 率为50%（3/6）；（3+）组29 例患儿中，失访8 例， 21 例可评价，缓解率为62%（13/21），复发率为 23%（3/13），病死率为43%（9/21）。SIRT1 阴 性组、SIRT1 阳性组及其各亚组间在缓解率、复发 率上差异均无统计学意义（均P>0.05）；仅SIRT1 阴性组病死率明显低于（3+）组（P<0.05）。 2.3　两组患儿生存分析结果

SIRT1 阴性组2 年OS 率（100%）高于SIRT1 阳性组[（44.9±15.5）%，P=0.048]（ 图 2）； SIRT1 阴性组2 年EFS 率（100%）高于SIRT1 阳 性组[（53.0±9.0)%，P=0.033]，见图 3。

图 2

图 2 SIRT1 阴性与阳性患儿2 年总生存分析

图 3

图 3 SIRT1 阴性与阳性患儿2 年无事件生存分析

在排除了性别、年龄、FAB 分型、初诊时外 周血白细胞计数、初诊时骨髓幼稚细胞比例、染 色体、融合基因等影响因素的影响后，仅SIRT1 阳性表达水平不利于患儿的长期生存（P=0.045， 危险系数绝对值=2.071，95%CI：1.017~4.219）。 3　讨论

SIRT1 广泛表达于胎儿及成人组织中，其生 理功能涉及基因转录沉默、细胞生长周期调节、 能量代谢、血管生成、神经保护及细胞衰老等。 SIRT1 通过对染色质结构、染色质重塑和基因表达 的决定作用来影响不同的细胞过程^[14]。

本研究共检测54 例AML 患儿骨髓活检组织 中SIRT1 蛋白的表达情况，其中有44 例（82%） SIRT1 表达阳性，进一步对这54 例患儿临床治疗 情况及预后随访进行研究后发现，SIRT1 阴性患儿 的预后普遍优于SIRT1 阳性患儿，生存分析显示： SIRT1 阴性组无论是在2 年OS 还是2 年EFS 均明 显高于SIRT1 阳性组。Cox 多因素回归分析方法 检测也显示：在排除了性别、年龄、FAB 分型、 初诊时外周血白细胞计数、初诊时骨髓幼稚细胞 比例、染色体、融合基因等影响因素的影响后， SIRT1 阳性仍是不利于患儿的长期生存的独立因 素。上述结果提示：高表达的SIRT1 在儿童AML 的发生发展中很可能扮演了促进肿瘤细胞增殖、 抑制肿瘤细胞凋亡的作用。本研究结果跟目前国 际上报道的关于SIRT1 在CML 耐药复发过程中所 起的作用基本一致。Yuan 等^[15] 报道：对于原发性 或继发性耐药的CML 细胞，酪氨酸激酶抑制剂显 得有些无能为力，研究其分子生物学特征，发现 该部分细胞多高表达SIRT1，提示SIRT1 的高表达 对于CML 的耐药起到了一定的作用。Li 等^[16] 同样 发现：酪氨酸激酶抑制剂对于CML 中静止期的白 血病干细胞作用非常有限，而这些静止期的白血 病干细胞上检测出有高表达的SIRT1，应用SIRT1 抑制剂或敲除SIRT1 基因后，CML 小鼠体内或体 外的静止期CML 白血病细胞均加速凋亡。O'Hare 等^[17] 同样在CML 的靶向治疗中提到了SIRT1 的重 要作用。

综上所述，SIRT1 在半数以上AML 患儿骨髓 活检组织表达，且高表达与AML 患儿不良预后相 关。但由于儿童活检存在技术难度，本研究样本 量有限，有必要进行大样本量临床验证，为儿童 AML 寻找有意义的预测预后的分子标志。