非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma, NHL）是一组高度异质性的淋巴组织恶性增殖性肿 瘤，在小儿多为弥漫性、高度恶性病变，确切病 因不明。紧密连接蛋白（zonula occludens,ZO-1） 属于膜结合鸟苷酸激酶家族成员，是一个血液肿 瘤相关抑癌基因，表达于多种细胞表面，参与细 胞增殖、分化、免疫调节，与肿瘤转移、进展密 切相关^{[1, 2]}。目前有关NHL ZO-1 基因启动子区甲 基化状态的研究罕见报道。因此为了探索NHL 的 病因及早期诊断的标记物，本研究对NHL 患儿进 行了ZO-1 基因甲基化的检测。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2006 年1 月至2012 年9 月于我院儿科 确诊为NHL（Ⅳ期）骨髓转移患儿55 例为研究对象。 所有患儿根据组织病理学、免疫表型、细胞遗传 学和分子病因学的检测确诊；根据影像学检查及 脑脊液、骨髓等检查按St.Jude 分期系统确定分期。 另选取我院同期非血液肿瘤患儿20 例为对照。55 例NHL 患儿中，男30 例，女25 例，年龄1~14 岁。 T 细胞型40 例，B 细胞型15 例。具体诊断、治疗 方案参照文献^[3]，整个化疗过程分为治疗前、化疗 早、中、后期、临床完全缓解及复发不同阶段进 行动态观察。化疗早期定为诱导期结束（化疗诱 导治疗后期，约为治疗第6~8 周）；化疗中期为 巩固治疗后期；化疗后期为疗程基本结束或维持 治疗前；临床完全缓解即骨髓中恶性肿瘤细胞数 小于5%，脑脊液无异常，外周血缓解，原有肿瘤 负荷消失，持续1 个月以上；复发：初治化疗6~8 周后缓解，在后续治疗及停药观察过程中，出现 原发部位或其他部位结内结外新发肿块，再次病 理证实和/ 或骨髓中淋巴瘤细胞≥ 5%。在化疗过 程中，5 例放弃治疗，3 例死亡，最终有47 例进 行连续动态观察，其中临床完全缓解29 例，复发 2 例，长期无病生存16 例。对照组20 例患儿中， 男11 例，女9 例，年龄1~14 岁。其中自身免疫 性溶血性贫血2 例，坏死性淋巴结炎2 例，特发 性血小板减少性紫癜5 例，再生障碍性贫血4 例， 传染性单核细胞增多综合征6 例，斑疹伤寒1 例。 1.2 骨髓标本的获取

留取所有患儿骨髓标本1~2 mL，涂片后送至 本院骨髓室检测骨髓中恶性肿瘤细胞百分数；剩 余放入密封枸橼酸钠抗凝管中，提取mRNA 后， -20℃冰箱保存。 1.3 MS-PCR 法检测骨髓细胞中ZO-1 基因甲基化程度 1.3.1 基因组DNA 提取

用Wizara DNA Clean- Up System（ 美国Pormega 公司） 提取骨髓细胞 DNA，分光光度计鉴定DNA 提取质量，A260/ A280 为1.8~1.9，根据所测浓度计算DNA 的量。 1.3.2 DNA 碱基修饰

取DNA 标本4 μg，注 射器抽吸剪切，取1 μg 剪切后的DNA 加ddH2O 至 终体积50 μL；加入5 μL 新配制的3 mol/L NaOH， 37 ℃ 孵育25 min； 取新鲜配置的10 mol/L 氢醌 30 μL、3 mol/L 亚硫酸氢钠520 μL 及10 mol/L NaOH 220 μL 迅速加入DNA 中，50~55 ℃ 孵育 16 h。 1.3.3 DNA 纯化

用V-Gene DNA 纯化试剂盒 纯化DNA，加入50 μL 的DNA 洗脱溶液（Eluent） 洗脱DNA；加入3 mol/L 的NaOH 5 μL，室温孵育 20 min；加入3 倍体积的无水乙醇，12 000 g 离心 10 min；室温干燥后的DNA 溶解于30 μL 水中， -20℃保存。 1.3.4 引物设计

由上海捷瑞生物技术有限公 司设计并合成。甲基化引物上游为ZO-1-MSF： 5'-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3'，下游 为ZO-1-MSR：5'-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA- 3'，扩增片段171 bp；非甲基化引物上游为 ZO-1-UMF：5'-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG- 3'，下游为ZO-1-UMR：5'-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA- 3'，扩增片段为179 bp。 1.3.5 MS-PCR

以硫化修饰、纯化后的基因组 DNA 为模板，分别用ZO-1 基因的甲基化及非甲基 化引物对进行扩增，PCR 产物应用2% 琼脂糖凝胶 电泳及紫外透射分析仪观察结果。每次实验均以 去离子水作为阴性对照。 1.3.6 PCR 产物鉴定

只有171 bp 甲基化特异 性扩增产物条带的标本，定为ZO-1 基因呈完全甲 基化状态；只有179 bp 非甲基化特异性扩增产物 条带的标本，定为ZO-1 基因呈完全非甲基化状态； 171 bp 甲基化特异性扩增产物条带和179 bp 非甲 基化特异性扩增产物条带都有的标本，定为ZO-1 基因呈部分甲基化状态。由于正常细胞为完全非 甲基化，故ZO-1 基因部分甲基化的可视为甲基化。 同时用凝胶成像系统半定量分析甲基化DNA 光密 度积分值（IOD 值）。 1.4 RT-PCR 法检测骨髓细胞中ZO-1 基因表达情况

采用MMLV RT-PCR Kit 试剂盒（美国Pormega 公司） 提取骨髓RNA，置于-80 ℃ 冻存或直 接用于反转录。引物由上海捷瑞生物技术有 限公司设计并合成。ZO-1 基因上游引物P1： 5'-GCGCTGGAGAGAGACAAGAT-3'，下游引物 P2：5'-ATTGACGTTCCCCACTCTG-3'，扩增片段 长度为179 bp。内参照引物β-actin 上游引物： 5'-GCCCTGGCGTCGTGATTAGT-3'，下游引物： 5'-TGTAATCCAGCAGGTCAGCAAAG-3'，扩增片 段长度为231 bp。反应条件：94℃预变性2 min； 94 ℃ 变性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸 2 min，共25 个循环。最后72℃再延伸5 min。将 扩增产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下摄片， 以目的基因/ 内参基因（OD 值）表示ZO-1 mRNA 水平。 1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学分 析。计数资料用百分率表示，组间比较采用卡方 检验或Fisher 确切概率法（当n<40 或理论频数<1 时）。两因素之间的相关性采用直线相关分析。 P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 MS-PCR 检测结果

55 例NHL 患儿治疗前39 例出现ZO-1 基因完 全性和部分甲基化条带，甲基化阳性率为71%； 对照组均呈非甲基化状态（图 1）。两组间甲 基化阳性率比较差异有统计学意义（χ²=29.55， P<0.001）。

图 1

图 1 两组ZO-1 基因甲基化状态 M：Marker （600 bp）； 1~2：病例组；3~4 对照组。病例组部分患儿治疗前ZO-1 基因呈 甲基化状态，对照组呈非甲基化状态。

进行连续动态观察的47 例患儿中，T 细胞 型32 例，治疗前ZO-1 基因甲基化阳性率为72% （23/32），化疗早期为66%（21/32），化疗中期 为56%（18/32），化疗后期为41%（13/32）；临 床完全缓解14 例（44%），仍有2 例可检出ZO-1 基因甲基化阳性；复发2 例（6%），甲基化状 态由部分甲基化条带转变为完全甲基化条带（图 2）。治疗前与化疗早期、中期ZO-1 基因甲基化 阳性率比较差异均无统计学意义（均P>0.05）， 与化疗后期比较差异有统计学意义（χ²=6.349， P=0.012）。B 细胞型15 例，治疗前ZO-1 基因甲 基化阳性率为67%（10/15），化疗早期为60% （9/15），化疗中期为53%（8/15），化疗后期为 27%（4/15）；临床完全缓解15 例（100%），均 未检出ZO-1 基因甲基化阳性。治疗前与化疗早期、 中期ZO-1 基因甲基化阳性率比较差异均无统计学 意义（均P>0.05），与化疗后期比较差异有统计 学意义（χ² =7.98，P=0.03）。T 细胞型（72%）与 B 细胞型（67%）治疗前ZO-1 基因甲基化阳性率 比较差异无统计学意义（χ²= 0.771，P=0.572）。

图 2

图 2 1 例复发患儿甲基化状态变化 M：Marker （600 bp）；1~2：复发前部分甲基化；3~4：复发后完全甲基化。 ZO-1 基因甲基化存在该患儿治疗前后。

病例组ZO-1 基因甲基化阳性者均无ZO-1 基 因mRNA 表达，对照组均有ZO-1 基因mRNA 表达。 表明ZO-1 基因甲基化阳性NHL 病例治疗前ZO-1 基因表达沉默。随着化疗进行，NHL 患儿ZO-1 基 因甲基化程度减弱，ZO-1 基因重新表达。见图 3。

图 3

图 3 动态观察NHL 患儿化疗过程中ZO-1 mRNA 表 达变化 M：Marker（600 bp）；1：治疗前；2：化疗早期； 3：化疗中期；4：化疗后期；5：对照组。随着化疗的进行，ZO-1 基因甲基化程度减弱，ZO-1 基因表达增多。

外周血白细胞总数与ZO-1 基因IOD 值无直线 相关性（r=0.093，P=0.575）；骨髓中恶性肿瘤细 胞数与ZO-1 基因IOD 值呈正相关关系（r=0.669， P<0.001）。提示ZO-1 基因甲基化程度与外周血白 细胞总数无相关，而与恶性肿瘤细胞数密切相关。 3 讨论

近年研究发现，肿瘤发生、发展的分子生物学 本质是细胞内遗传调控和表观遗传调控的紊乱^[4]。 表观遗传因素对抑癌基因表达调控的影响越来越 引起人们的重视，其中DNA 甲基化是导致抑癌基 因沉默的一种表观遗传修饰方式^[5]。DNA 甲基化 是指在DNA 甲基化转移酶的作用下，以S- 腺苷甲 硫氨酸作为供体将一活化的甲基基团引入DNA 链， 在基因组CpG 二核苷酸的胞嘧啶5' 碳位共价结合 一甲基基团，形成5- 甲基胞嘧啶^{[6, 7]}。其生物学功 能主要表现为基因组整体甲基化水平降低，局部 基因启动子区（CpG 岛）甲基化程度异常增高， 后者可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。 目前的研究表明，抑癌基因启动子区域异常甲基 化可能成为肿瘤早期诊断、预后判断和干预治疗 的新靶点^{[5, 8]}。

ZO-1 是1986 年Stevenson 等人应用特异性单 克隆抗体从小鼠肝细胞紧密连接结构中鉴定出来 的，它的表达产物是第一个被发现的紧密连接蛋 白，并被认为是一种重要的紧密连接骨架结构^{[9, 10]}。 ZO-1 基因位于人15 号染色体长臂1 区3 带，大小 为122 kb 左右。其编码蛋白位于细胞浆膜表面， 在维持细胞结构完整及细胞极性上起重要作用； 由于其含有SH3（Srchomology3）结构域，这种结 构在许多骨架蛋白和信号传递蛋白质中均存在， 因此预示ZO-1 参与细胞间通过紧密连接进行的信 号转导；ZO-1 基因在正常组织与癌症组织中的表 达水平有显著差异，正常组织的上皮紧密连接处 该基因高密度表达，在肿瘤组织中下降 69％，且 分化越差的肿瘤组织中，该基因表达水平越低， 表明ZO-1 的表达状况与肿瘤分化与癌演进密切相 关^[10]。

恶性淋巴瘤是起源于淋巴造血组织的实体瘤， 近年来发病率呈逐年上升趋势，分为霍奇金淋巴 瘤和NHL^[11]。NHL 是儿童时期常见的恶性肿瘤之 一，其发病率仅次于白血病和脑瘤，目前认为它 是一种全身性的疾病。因儿童NHL 分化程度低、 恶性程度高，常常在起病时即可呈广泛性、多灶 性分布，可累及中枢神经系统或骨髓^[12]。儿童 NHL 临床表现差异很大，呈现高度侵袭性过程， 几乎可以累及全身所有器官，多数患儿初诊时已 为Ⅲ期和Ⅳ期，因此早期诊断尤为重要。已有研 究表明ZO-1 基因与白血病、乳腺癌、胃肠癌、胰 腺癌等多种肿瘤发生发展密切相关^[13]，ZO-1 基因 启动子区在各种类型急性白血病中呈特异性高甲 基化状态，对ZO-1 进行检测可作为AL 早期诊断、 复发预测和指导个体化治疗的有效手段^[14]。杜瑜 等^[1] 研究证实ZO-1 基因启动子区甲基化与成人 NHL 分期及缓解明显相关，可以作为判断NHL 进 展和评价预后的辅助指标，并以此指导临床治疗。 本研究显示，NHL 患儿骨髓中ZO-1 基因呈高甲基 化状态，甲基化阳性率为71%，基因表达沉默， 提示儿童NHL ZO-1 基因启动子区域呈高甲基化且 ZO-1 基因失表达，甲基化对ZO-1 基因表达的抑制 作用可能是一个独立因素，ZO-1 基因高甲基化状 态在NHL 中具有较高的特异性，与NHL 发生发展 密切相关，可作为一种新的NHL 分子标志物。T 细胞型与B 细胞型比较，ZO-1 基因甲基化阳性率 无显著性差别，提示该检测可适用于NHL 不同类 型，涵盖率较高。达到临床完全缓解的患儿仍有 部分可检出ZO-1 基因甲基化状态，提示预后不良 或有可能复发，说明ZO-1 基因可能作为微小残留 病的监测指标。

进一步动态观察发现，实验组患儿随着化疗 的进行，ZO-1 基因高甲基化状态逐渐减少，基因 表达逐渐增多，临床缓解时甲基化状态消失，其 基因重新表达，而复发病例又重新出现ZO-1 基因 高甲基化状态，提示ZO-1 基因可动态评价临床疗 效，也进一步说明ZO-1 基因的表达受其启动子区 甲基化状态调控，且甲基化对基因表达的抑制作 用是一个可逆的过程。在后基因组学的表观遗传 学时代，从表观遗传学角度防治疾病是当前的主 要方向。经去甲基化药物处理后被高甲基化抑制 的基因可以重新得到表达，因而去甲基化治疗成 为血液肿瘤治疗关注的热点。目前已有DNA 甲基 转移酶抑制剂用于治疗MDS、慢性粒细胞白血病、 难治性皮肤恶性T 细胞淋巴瘤等血液肿瘤疾病， 并取得一定疗效^{[15, 16]}。ZO-1 基因甲基化能否成为 儿童NHL 治疗的靶点值得进一步研究。

综上所述，ZO-1 基因可能作为儿童NHL 早 期发现、疗效判断、微小残留检测、预告化疗缓 解后肿瘤复发的有效指标，并以此指导临床治疗。 有望成为NHL 去甲基化治疗的靶点，对提高儿童 NHL 生存率、改善预后有着重要意义。本研究仅 作了ZO-1 基因甲基化状态与儿童NHL 关系的初 步研究，尚有待于扩大样本量进一步研究。