甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia, MMA） 是由甲基丙二酰辅酶A 变位酶 （methylmalonyl-CoAmutase,MCM）或其辅酶腺苷 钴胺素（Ado-Cb1）缺陷导致的一种常染色体隐性 遗传代谢性疾病。其患病率在美国为1 : 48 000， 日本为1 : 50 000^[1]，国内患病率尚不清楚，但对临 床疑似患儿进行串联质谱检测发现MMA 患儿并不 少见^[2]。正常情况下，甲基丙二酸在MCM 和Ado- Cbl 作用下转变成琥珀酰辅酶A 参与三羧酸循环， MCM 活性不足或维生素B₁₂ 代谢障碍可导致甲基 丙二酸及其前体丙酸、甲基枸橼酸等代谢物的异 常蓄积，从而引起神经、肾脏、肝脏等多系统损 伤^{[3, 4]}。微小RNA（microRNA，miRNA） 是一类 长约22 个核苷酸的非编码单链RNA，它可以通过 与靶基因的3' 端非翻译区（3'-UTR）互补配对抑 制基因转录后表达，从而参与细胞增殖、分化、 发育、凋亡等多种生物过程。近年来研究表明， miRNA 在疾病状态下可异常表达且具有检测方法 灵敏、准确等特点，这提示miRNA 可能作为潜在 的生物标记物辅助相关疾病的诊断^[5]。生物信息 学工具预测发现miR-9 有众多可预测的下游靶基 因，而研究亦证实miR-9 在生物发育、细胞增殖、 凋亡和神经前体细胞分化过程中起着重要的调控 作用。本研究通过检测MMA 患儿与健康人之间 miRNA 的表达差异，以寻找合适的生物标志物来 辅助MMA 的诊断。 1　资料与方法 1.1　研究对象

所有MMA 病例来自2011 年8 月至2013 年6 月就诊于郑州大学第一附属医院及郑州 大学第三附属医院的患儿，共收集17 例MMA 患儿、10 例非MMA 的高同型半胱氨酸血症 （hyperhomocysteinemia）患者及10 例健康对照者 的血浆样本。MMA 患儿的诊断标准参照文献^[6]。 尿液样本送至北京儿童医院进行气相色谱- 质谱 （GC-MS）定量测定甲基丙二酸含量。结合临床表 现、影像学及生化学检查后确诊为MMA。

17 例MMA 患儿根据血浆同型半胱氨酸 （Hcy）水平进行分组：Hcy>16 μmol/L 者为MMA 合并HHcy 组（MMA+HHcy 组，12 例）；Hcy ≤ 16 μmol/L 者为MMA 未合并HHcy 组（MMA 组， 5 例）。上述病例中经维生素B₁₂ 治疗并具有一定 家庭经济能力的5 例患儿于治疗3 周后将其尿液 样本送至北京儿童医院复查GC/MS。

由于单纯HHcy 在青少年中少见，故本研究 中HHcy 组年龄较其他各组大（P<0.05），余各组 间性别，年龄差异无统计学意义。各组患儿临床 基本资料见表 1。

表 1(Table 1)

表1　各组患儿临床基本资料

表 1HME 家系基本临床资料

采集患儿资料并建立档案，留取外周血。本 研究经我院医学伦理委员会批准，患儿家长知情 并签署知情同意书。 1.2　主要试剂

miRcute miRNA isolation Kit（DP501） 购自Tiangen 公司，Reverse Transcriprition System（A3500）、Gotaq qPCR Master Mix （A6001） 购自Promega 公司，miR-9-1 引物购 自广州锐博生物科技有限公司（ 序列Forward 5'-TCATAAAGCTAGATAACCGAAGAT-3'； Reverse 5'-TCCAGAGGCGACCCAGAGC-3'）。 1.3　血浆标本的收集

参照Kim 等^[7] 方法，抽取患儿外周血3 mL， 收集于氟化钠（NaF）管中，采用4℃、3 000 r/min 离心15 min，取上层血浆置于-80℃冰箱备用。 1.4　血浆miRNA 的抽提

按照miRcute miRNA 提取分离试剂盒说明书 进行抽提miRNA。 1.5　微阵列基因芯片

选取MMA 患儿和健康对照各5 例进行 miRNA 微阵列基因芯片检测，其中MMA 组男3 例， 女2 例，平均年龄13.4±2.1 岁; 对照组男2 例， 女3 例，平均年龄13.4±1.7 岁。两组性别、年龄 差异无统计学意义（P>0.05）。

由 LC Sciences 提供技术服务，在 MMA 患儿 和健康对照组血浆 miRNA 3' 端加上poly（A）尾， 并将寡聚核苷酸标记与 poly（A） 尾连接。将标记 产物、含有 25% 甲酰胺的 100 μL 6xSSPE 缓冲液 混合后在 LC Sciences 微阵列基因芯片上杂交过夜， 杂交温度为34℃。杂交后与标记特异结合的 Cy3 染料进行染色。利用GenePix 4000B 采集杂交图像 并使用Array-Pro 进行图像数字化转换。所得数值 减除背景值后，采用 LOWESS 法进行信号归一化， t 检验进行两组差异表达基因分析。 1.6　RT-PCR

MMA+HHcy 组、单纯MMA 组、单纯HHcy 组及MMA+HHHcy 治疗组（经维生素B12 治疗并 复查尿甲基丙二酸含量）进行实时荧光定量PCR （RT-PCR）检测。另检测10 例健康儿童作为对照。

根据 Reverse Transcription System 说明书，将 miRNA 逆转录为cDNA。按照Gotaq qPCR Master Mix 说明书进行荧光定量检测，以5S 为内参。记 录相应的Ct 值，miRNA 相对表达量采用公式2-△△ Ct 方法计算，每例样本重复3 次，整个实验采用盲法。 1.7　统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。计 量资料采用均数± 标准差或中位数（四分位数） [M（P25,P75）] 表示，正态分布连续变量资料采 用t 检验，非连续变量资料采用卡方检验，非正态 分布连续变量资料采用秩和检验，相关性分析采 用Pearson 相关性分析方法，P<0.05 为差异有统计 学意义。 2　结果

2.1　尿液甲基丙二酸倍率

GC-MS 测定尿液甲基丙二酸倍率（ 倍率 = 分析值/ 基准值，基准值为0.001） 显示， MMA+HHcy 治疗组甲基丙二酸倍率显著低于 MMA+Hcy 组及 MMA 组（P<0.01），见表 2。

表 2(Table 1)

表2　HME 家系基本临床资料

表 2HME 家系基本临床资料

miRNA 微阵列基因芯片筛选出具有表达差异 的miRNA 有 26 个，其中上调2 倍以上的有miR- 144-3p、miR-4687-3p、miR-30c-1 等10 个，下调 的有miR-9-1、miR-191-5p、miR-30a-5p 等16 个，见 图1。

图 1 微阵列芯片聚类图　 上调2 倍以上的有miR-144- 3p、miR-4687-3p、miR-30c-1 等10 个，下调的有miR-9-1、miR- 191-5p、miR-30a-5p 等16 个。

MMA + HHcy 组miR-9-1 相对表达量为 （1.11±0.95）×10-3，MMA 组为（2.46±2.91） ×10-2，HHcy 组为 0.161±0.119，MMA+HHcy 治 疗组为0.214±0.023，健康对照组为0.250±0.103， 其中MMA+Hcy、MMA 及HHcy 组与健康对照组比 较差异均有统计学意义（P<0.01），MMA+HHcy 治疗组与健康对照组比较差异无统计学意义，见图 2 ；且在 MMA+HHcy 组及 MMA 组中 甲基丙二 酸倍率值越高，miR-9-1 相对表达量越低，相关 系数分别为-0.789、-0.867，见图3A、3C，而在 MMA+HHcy 组及HHcy 组中 miR-9-1 相对表达量 与血Hcy 值无相关性，见图 3B、3D 。

图 2 各组 miR-9-1 的相对表达量　　　 a 为与NC 组( 健 康对照) 比较，P<0.01；b 为与MMA+Hcy 组比较，P<0.01。

图 3 　　miR-9-1 表达与尿甲基丙二酸倍率、血Hcy 值 的相关性　　　　 A：MMA+HHcy 组，尿甲基丙二酸倍率与miR-9-1 表达呈负相关（r=-0.789，P=0.007）；B：HHcy 组，miR-9-1 表 达与血Hcy 值无相关性；C：MMA 组，尿甲基丙二酸倍率与miR- 9-1 表达呈负相关（r=-0.867，P=0.04）；D：MMA+HHcy 组， miR-9-1 表达与血Hcy 值无相关性。

2.3　miR-9-1 对MMA 的诊断效能

ROC 曲线分析结果显示，利用 miR-9-1 的相 对表达量对 MMA 进行诊断时，ROC 曲线下面积为 0.974。若以0.027 为诊断临界值，即miR-9-1 相对 表达量低于0.027 时诊断为MMA，约登指数最大， 为0.832，灵敏度和特异度分别为0.95、0.882，见图 4 。

图 4 通过血浆miR-9-1 相对表达量诊断MMA 的曲线下面积（AUC）

3　讨论

本研究发现MMA+HHcy 组及MMA 组中甲基 丙二酸倍率越高，miR-9-1 相对表达量越低，而在 MMA+HHcy 组及HHcy 组中血Hcy 值与miR-9-1 相对表达量无相关性。这提示MMA 患儿甲基丙二 酸蓄积量可能在miR-9-1 的下调中起主导作用，而 MMA+HHcy 组miR-9-1 相对表达量明显低于MMA 组及HHcy 组，则可能是由甲基丙二酸及Hcy 的 共同作用引起。MMA+HHcy 治疗组复查尿甲基丙 二酸倍率较治疗前显著下调，提示患儿治疗后病 情控制较好，此时检测miR-9-1 相对表达量明显上 调，基本恢复正常人水平，推测miR-9-1 可能是反 映治疗效果及病情状况的一个指标。

MMA 造成脑损伤的机制尚不十分明确，有研 究表明其可能通过抑制三羧酸循环途径以及氧化 磷酸化，导致线粒体功能障碍，诱发氧化应激以 及兴奋性毒性，从而诱导神经元细胞发生凋亡^{[8, 9]}。 最新研究发现将 甲基丙二酸经皮下注射至 Wistar 大鼠体内可引起大鼠血液中多形核白细胞的减少 及皮质组织中 IL-1β、TNFα、iNOS 表达水平的 增高，由此推测神经炎症机制可能参与了 MMA 患 儿脑损伤的过程^[10]。

关于 miR-9-1 在 MMA 中的作用机制，目前国 内尚无相关报道。研究表明miR-9-1 可能对炎症 因子起到一定的抑制作用。如Jones 等^[11] 报道在 人骨关节炎软骨细胞过表达miR-9 可使IL-1β 诱 导产生的 TNFα 减少40%，提示miR-9 可能对骨 关节炎疾病起到保护作用。Kaneko 等^[12] 在交感性 眼炎患儿的眼球样本中发现miR-9 下调，并证实 miR-9 可负调控靶基因TNFα 及NF-κB1，而后二 者与线粒体氧化应激介导的光感受器凋亡有关。 Bazzoni 等^[13] 研究发现TLR-4 激活的NF-κB1 可诱 导多形核中性白细胞与单核细胞中的miR-9 上调， 而miR-9 形成的负反馈通路可对 NF-κB 家族成员 的表达进行调控。本研究发现miR-9-1 在MMA 患 儿血浆中下调，为国内首次报道，推测可能是由 于MMA 引起的炎症反应超过了miR-9-1 的抑制 作用，这为miR-9-1 是否可作为MMA 治疗靶点 提供了新思路。但亦有一些报道不能解释本研究 发现，如Liu 等^[14] 报道在由LPS 介导的炎症反应 中miR-9上调，提示其与炎症反应有关；还有研 究发现miR-9 可在转录后水平抑制NF-κB1 表达， 而后者已被证实具有抗凋亡作用^{[15, 16]}，故miR-9-1 在MMA 中下调的原因和机制尚需进一步研究。而 miR-9-1 表达水平与MMA 进展过程的深层关系仍 需进一步扩大样本量进行验证，miR-9-1 在MMA 中的可能作用机制亦需进一步研究。

总之，miR-9-1 在MMA 患儿血浆中显著下调， 维生素B12 治疗后显著上调，且在尿中甲基丙二酸 值越增高，miR-9-1 下调越明显，可作为潜在的生 物标记物辅助MMA 的诊断，从而监测病情的变化。