气道炎症和气道重塑是支气管哮喘重要的病 理生理特征^[1]，其发生机制复杂，目前仍未完全阐 明。许多证据显示，Th1/Th2 细胞免疫功能紊乱是 支气管哮喘发病的中心环节，导致多种细胞因子 和炎症介质的产生，参与了气道炎症和气道重塑 的发生、发展。Th1/Th2 细胞的分化受到许多因素 影响，其中Notch 信号通路通过激活靶基因Hes-1 等也参与了Th 细胞分化的调节^[2]，但是其与支气 管哮喘气道炎症和气道重塑间的关系研究甚少， 国内尚未见报道。因此，本研究拟建立大鼠哮喘 模型，观察Hes-1 的表达变化及与哮喘大鼠气道炎 症和气道重塑间的关系，以期为阐明哮喘发病机 制及寻求新的治疗方法提供思路和依据。 1 资料与方法 1.1 实验动物及材料

清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由四川 大学华西医学中心实验动物中心提供；卵白蛋白 （OVA）购自美国Sigma 公司，白细胞介素4（IL- 4）、INF-γ ELISA 试剂盒购自美国Invitrogen 公司， 小鼠抗大鼠Hes-1 单克隆抗体为英国Abcam 公司 产品。 1.2 动物分组与哮喘模型的建立

生后6 周龄雄性SD 大鼠48 只，平均体重 149±12 g，按随机数字表法随机分为对照组和哮 喘组，两组依据不同处理时间点各分为4 周、8 周、12 周3 个亚组，每组8 只大鼠。哮喘大鼠气 道重塑模型的建立参考文献方法^[3] 并加以改良： （1）致敏：第1 天和第8 天腹腔注射1 mL 0.1% OVA（1 mg）加Al(OH)3（100 mg）混合液致敏； （2）激发：第15 天开始以1% OVA 雾化吸入激发， 每次35 min，隔天1 次，分别激发4 周、8 周及12 周。 在相应时间点致敏与激发时以生理盐水代替OVA 建立对照组。 1.3 标本收集

末次激发后2 h，予大鼠10% 水合氯醛 400 mg/kg 腹腔注射麻醉，心脏穿刺取血后标本于 4 ℃ 静置2 h，3 000 r/min 离心15 min，吸取血清 于-80℃保存备用。即刻打开胸腔，暴露肺组织， 气管切开插管，结扎右主支气管，用2 mL 生理盐 水于气管插管处注入，缓慢灌洗左肺，并用手指 轻轻按摩肺组织约30 s 后回收支气管肺泡灌洗液 （BALF），共3 次，保留回收率高于80% 的标本， 1 800 r/min 离心15 min，取上清分装于EP 管中， -80℃保存备用。切取右肺近肺门组织，4% 多聚 甲醛固定，常规石蜡包埋切片，进行苏木精- 伊 红（HE）染色及免疫组织化学检测；其余肺组织 液氮保存用于PCR 检测。 1.4 支气管平滑肌厚度的测定

参照文献^[3] 方法，在200 倍光镜下，每只大 鼠随机取3 张切片，挑选每张切片中有完整横断 面的中小支气管3 支，应用Image Pro Plus 图像 分析软件测量基底膜周径（Pbm），单位长度基 底膜的平滑肌厚度（Wam，μm²/μm）=[ 平滑肌外 缘内气管厚度（Wam1）- 平滑肌内缘内气管厚度 （Wam2）] /Pbm。 1.5 IL-4 和INF-γ 浓度的测定

应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清 和BALF 中IL-4、INF-γ 的浓度，测定方法按产 品说明书进行操作。 1.6 免疫组织化学法检测肺组织Hes-1 蛋白的表 达

切片经常规脱蜡至水，水化，微波修复，阻 断内源性过氧化氢酶和非特异性反应，滴加小鼠 抗大鼠Hes-1 单克隆抗体（稀释度为1 : 200），4℃ 过夜；洗涤后滴加二抗及SP 工作液，3，3- 二氨 基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水，透明， 树胶封片。阳性结果呈棕黄色，集中表达于气道 上皮细胞、平滑肌细胞胞浆。每只大鼠随机取3 张切片，每张切片随机选择3 个200 倍镜下支气 管视野，应用Image Pro PLus 图像分析软件测定阳 性部位的平均吸光度（OD），用以代表阳性部位 的蛋白表达水平。 1.7 实时荧光定量PCR 法检测肺组织Hes-1 mRNA 的变化

大鼠肺组织加入TRIzol 进行总RNA 提取， 其后采用Two-Step Real Time-PCR 试剂盒（ 大连 宝生生物公司）合成cDNA 用于PCR 扩增。根据 NCBI Genebank 中大鼠Hes-1、GAPDH 基因序列 设计引物（上海生工生物工程公司）（表 1）。 在FTC2000 型荧光定量PCR 仪上进行PCR 反应： 94℃预变性2 min；94℃变性20 s，56℃退火30 s， 60℃延伸40 s，进行45 个循环。得到样品的Ct值（每个反应管内荧光信号到达设定阈值时所 经历的循环数）。采用2^{- △△ Ct}法进行统计分析 [ △△ Ct=（Ct_{哮喘组Hes-1}-Ct_{哮喘组GAPDH}）-（Ct_{对照组Hes-1} -Ct_{对照组GAPDH}）]。

表 1(Table 1)

表1 PCR 反应中所用引物序列

表 1PCR 反应中所用引物序列

采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分 析。计量资料采用均数± 标准差（x±s）表示， 两组均数间的比较采用t 检验；多组均数间比较采 用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni 法；变量间的相关分析采用Pearson 相关分析， P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 HE 染色观察肺组织病理改变及Wam 测定

对照组大鼠肺组织结构完整，支气管管腔形 态规则，黏膜上皮完整，少见炎性细胞浸润。哮 喘组大鼠黏膜下、支气管及血管周围大量的炎性 细胞浸润、黏膜下水肿、黏液腺增生、支气管壁 明显增厚，基底膜增厚且不规则，支气管平滑肌 增厚，各时间点Wam 均明显高于相应时间点对 照组（均P<0.01）；且随着激发时间延长，哮喘 组Wam 逐渐增厚，与4 周时相比，8 周及12 周时 Wam 差异有统计学意义（P<0.05）。对照组不同 时间点Wam 的差异均无统计学意义（P>0.05）， 见表 2和图 1。

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠不同时间点Wam 结果  （x±s,μm2/μm） 注：a 为与同组4 周时相比，P<0.05。

表 2各组大鼠不同时间点Wam 结果  （x±s,μm2/μm）

图 1 各组大鼠肺组织苏木精- 伊红染色结果（×400） 对照组大鼠支气管管腔通畅，黏膜上皮完整，少见 炎性细胞浸润，基底膜厚度正常、一致。哮喘组大鼠支气管上皮下及周围见大量炎性细胞浸润，黏膜水肿、黏液腺增生， 支气管平滑肌增厚、管腔狭窄，且随着激发时间延长上述改变愈加明显。

哮喘组血清、BAFL 中的IL-4 浓度均明显高 于同时间点对照组（均P<0.05），随着激发时间 延长，IL-4 浓度逐渐升高，与4 周时相比，8 周 及12 周时IL-4 浓度均显著升高（均P<0.01）。哮 喘组血清和BAFL 中的INF-γ 浓度均低于同时间 点对照组（均P<0.01），且随着激发时间延长， INF-γ 浓度逐渐降低，与4 周时相比，8 周及12 周时INF-γ 浓度均显著降低（均P<0.01）。见表 3~4。

表 3(Table 3)

表 3 血清中IL-4 和INF-γ 浓度　  （x±s,pg/mL） 注：a 为与同组4 周时相比，P<0.01。

表 3 血清中IL-4 和INF-γ 浓度　  （x±s,pg/mL）

表 4(Table 4)

表 4 BALF 中IL-4 和INF-γ 浓度  （x±s,pg/mL） 注：a 为与同组4 周时相比，P<0.01。

表 4 BALF 中IL-4 和INF-γ 浓度  （x±s,pg/mL）

Hes-1 蛋白阳性结果呈棕黄色，主要表达于支 气管上皮细胞和平滑肌细胞。哮喘组的蛋白表达 均明显高于同时间点对照组（均P<0.01），且随 着激发时间延长，Hes-1 蛋白阳性表达增加，与4 周时相比，8 周及12 周时Hes-1 蛋白水平均显著 升高（均P<0.01）。对照组各时间点间Hes-1 蛋 白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表 5 和图 2。

表 5(Table 5)

表 5 大鼠肺组织Hes-1 蛋白表达  （x±s） 注：a 为与同组4 周时相比，P<0.01。

表 5 大鼠肺组织Hes-1 蛋白表达  （x±s）

图 2 各组大鼠肺组织Hes-1 蛋白的表达（DAB 显色，×400） 对照组大鼠肺组织中Hes-1 蛋白表达少； 而在哮喘组大鼠支气管上皮细胞、平滑肌细胞上Hes-1 蛋白表达增多，且随着激发时间延长Hes-1 蛋白表达明 显增多。Hes-1 蛋白阳性结果呈棕黄色。

哮喘组Hes-1 mRNA 的表达均明显高于同时 间点对照组（均P<0.05），且随着激发时间延 长，Hes-1 mRNA 表达水平增高，与4 周时相比， 8 周及12 周时Hes-1 mRNA 水平均显著升高（均 P<0.01）。对照组各时间点Hes-1 mRNA 表达差异 无统计学意义（P>0.05）。见表 6。

表 6(Table 6)

表 6 大鼠肺组织Hes-1 mRNA 的表达  （x±s） 注：a 为与同组4 周时相比，P<0.01。

表 6 大鼠肺组织Hes-1 mRNA 的表达  （x±s）

哮喘组Hes-1 蛋白和mRNA 的表达与Wam 呈 正相关（分别r=0.833、0.839，均P<0.01）；哮喘 组Hes-1 mRNA 的表达与血清及BALF 中INF-γ 的浓度呈负相关（ 分别r=-0.929、-0.858，均 P<0.01），与血清及BALF 中IL-4 水平呈正相关（分 别r=0.883、0.924，均P<0.01）；哮喘组Hes-1 蛋 白的表达与血清及BALF 中INF-γ 的浓度呈负相 关（分别r=-0.946、-0.888，均P<0.01），与血清 及BALF 中IL-4 水平呈正相关（分别r=0.938、0.946， 均P<0.01）。 3 讨论

支气管哮喘是一种影响儿童健康和生长发育 最常见的的慢性呼吸道疾病。有研究显示，哮喘 发病的中心环节是由于Th2 细胞过度活化，释放 细胞因子，并激活多种炎症细胞和结构细胞共同 参与的气道慢性炎症，炎症持续存在并且损伤反 复进行修复，最后引起气道重塑，是导致难治性 哮喘重要的病理生理学基础^[4]。因此，为阻断哮喘 的发生、发展，有必要深入研究影响Th2 细胞活 化的机制并寻求相应的解决办法。

Th 细胞分化受到许多因素调节，近年来 Notch 信号通路的作用倍受关注。完整的Notch 信 号通路包括Notch 受体、配体、细胞内效应分子、 其他效应物及调节分子等。Notch 受体是一组异二 聚体组成的细胞表面受体，哺乳动物中共发现4 种Notch 受体，分别为Notch1~4，Notch 配体与受 体一样为I 型跨膜蛋白，当配体与受体结合后， Notch 受体发生2 次蛋白水解，其后释放出Notch 胞内结构域NICD 移至核内，激活下游基因如 Hes-1 等转录。目前许多研究显示Notch 信号通路 促进了Th2 细胞的分化。当肺树状突细胞受屋尘 螨刺激后，Notch 配体Jagged2 上调，促进了Th2 细胞分化^[5]；Notch 信号通路抑制剂GSI 可减轻哮 喘小鼠气道嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞化生等 炎症反应及气道反应性，降低血中IgE 水平；体外 培养的BALF 细胞经GSI 处理后Th2 细胞反应减轻， Th1 细胞因子水平增高^[6]。哮喘小鼠肺内Notch 基 因表达增高^[7]，经Notch 信号通路另一种抑制剂 MW167 处理后，血及BALF 中IL-4 水平降低，肺 内T 细胞中IL-4mRNA 表达减少^[8]。与文献报道类 似，本研究中大鼠经OVA 致敏及反复激发后，肺 组织表现出典型哮喘的改变，BALF 及血清中Th1 细胞因子INF-γ 水平降低，而Th2 细胞因子水平 IL-4 升高；同时哮喘大鼠Notch 信号通路效应因子 Hes-1 蛋白及mRNA 水平较对照组明显升高，随着 激发时间延长，增高趋势越明显；此外，Hes-1 蛋 白及mRNA 表达与Th2 炎症因子IL-4 水平呈正相关，与Th1 细胞因子INF-γ 水平呈负相关，提示 Hes-1 与哮喘大鼠Th2 细胞功能亢进有密切联系， 参与了哮喘气道慢性炎症的发生。

气道在慢性炎症的刺激下，可发生结构改变 即气道重塑，其发生与气道内炎性细胞释放的炎 症促进因子和生长因子有关。气道重塑的重要表 现之一是气道平滑肌细胞在炎症刺激下增生、增 厚^{[4, 9]}。国内有文献报道Notch1 促进了哮喘气道重 塑，哮喘大鼠Notch1 基因表达增加，并与气道重 塑特异性指标α- 肌动蛋白呈正相关^[10]。本研究 中，哮喘大鼠随着激发时间延长，炎症细胞浸润， 气道平滑肌厚度也逐渐增加，符合气道重塑表现， 与文献报道类似；同时气道平滑肌厚度与Notch 信 号通路靶基因Hes-1 蛋白及mRNA 水平呈正相关， 提示Hes-1 参与了哮喘大鼠气道重塑的发生。

综上所述，本研究中Notch 信号通路靶基因 Hes-1 蛋白及mRNA 表达与哮喘大鼠气道炎症因子 水平和气道重塑密切相关，可能参与了哮喘的发生， 阻断该信号通路可能对哮喘有潜在的治疗价值。