新生儿难治性惊厥以新生儿期起病的反复惊 厥发作，止惊药物难以控制为特点，常遗留癫癎、 发育落后等神经系统后遗症^{[ 1 ]}。结合儿童难治性癫 癎的定义和文献报道将需长期应用2 种以上止惊 药物控制惊厥发作，或仍不能控制惊厥发作的一 类新生儿惊厥称为难治性惊厥^{[ 1, 2, 3, 4 ]}。这类疾病常见 的病因是严重围产期脑损伤、先天遗传代谢性疾 病及脑发育畸形等，但在实际临床工作中有相当 一部分患儿难以找到明确病因。STXBP1 基因突变 是近年来发现的早发癫癎脑病的致病突变之一， 存在该突变的患儿常以新生儿期出现的难治性惊 厥起病，部分病例表现为大田原综合征或在新生 儿期后发展为婴儿痉挛症及其他类型难治性癫癎， 遗留发育落后等神经系统后遗症^{[ 5 ]}，国内尚无新生 儿惊厥患儿存在该基因突变的报道。本研究对病 因不明的新生儿难治性惊厥患儿进行STXBP1 基因 突变的检测，探讨该类疾病与STXBP1 基因突变的 关系，报告如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象

我院新生儿病房于2012 年1 月1 日至2013 年2 月1 日收治的不明原因的难治性惊厥新生儿。 入组标准：（1）临床诊断符合新生儿难治性惊厥： 新生儿期起病的惊厥发作，应用2 种以上止惊药 物维持治疗；（2）病因不明。对每例患儿进行血 电解质、血糖、头颅磁共振、血和尿代谢筛查的 检查，除外围产期脑损伤、脑结构发育异常及先 天性代谢性疾病等引起新生儿难治性惊厥的常见 病因。符合入组条件的患儿共11 例。本研究获得 我院伦理委员会批准及家长书面知情同意。 1.2 DNA 提取

对患儿及其父母采集外周血各2 mL，EDTA 抗凝，采用试剂盒法提取淋巴细胞基因组DNA。 1.3 PCR 扩增

STXBP1 共有20 个外显子，其DNA 序列来 自GenBank，NM_003165.3。参考文献^{[ 6 ]} 并应用 Primer 3.0 设计引物，引物由诺赛基因公司合成。 PCR 扩增编码区，反应在20 μL 的反应体系中进行： 2×GC 缓冲液10 μL，dNTPs（10 Mm）1 μL，DNA （100~200 ng/μL）1 μL，primer-F（10 μM）1 μL， primer-R（10 μM）1 μL，Taq DNA 聚合酶（2 U/ μL）1 μL ，去离子水5 μL。反应条件采用Touch Down PCR。 1.4 基因测序及结果分析

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京诺 赛基因组研究中心有限责任公司进行测序，应用 ABI3100 测序仪正向测序。测序结果应用DNAStar 软件及Chromas 2 进行分析。如发现突变，对突变 外显子进行二次反向测序以核实，通过数据库检 索突变是否引起氨基酸改变、是否为单核苷酸多 态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）、是 否为已报道的致病突变。如发现致病突变，需对 突变患儿父母进行该基因检测，以明确突变来源 及是否为新发突变。 2 结果 2.1 基因检测结果

本研究收集的不明原因难治性新生儿惊厥患 儿11 例中，发现1 例患儿存在STXBP1 基因突 变，该突变为杂合突变，突变位点位于STXBP1 基 因的第16 外显子，双链DNA 之一的编码序列第 1 439 位碱基由胞嘧啶（C）变为胸腺嘧啶（T）引 起氨基酸改变，第480 个氨基酸由脯氨酸（密码 子CCG，简写P）变为亮氨酸（密码子CTG，简 写L），为错义突变：c.1439C>T（p.P480L）（图 1）。经文献查询该突变为已报道致病突变^{[ 5 ]}。对 该患儿父母进行STXBP1 基因检测，未发现该位点 存在突变（图 1），证实该患儿突变为新生突变。 其他10 例患儿应用PCR 直接检测STXBP1 编码区 突变未发现阳性结果。

图 1

Fig. 1

图 1 STXBP1 基因突变c.1439C>T（p.P480L） 患儿DNA 双链之一编码序列第1 439 位碱基由C 变为T，发生氨 基酸改变，为错义突变。患儿父母该位点未发现突变。

存在STXBP1 突变患儿为第2 胎第1 产，胎 龄39⁺¹周顺产娩出，出生体重3 350 g，无产前宫 内窘迫及生后窒息。母亲孕期规律产检，无不良 产史，第1 胎为人工流产。否认妊娠期高血压及 妊娠期糖尿病病史，否认类似疾病家族史。患儿 生后第2 天起病，发作表现为双眼凝视、头部及 四肢抖动，数秒后缓解，每日1~3 次。生后20 余 天发作频繁，出现成串痉挛发作，每日10 余串， 每串10 余次，生后40 余天就诊于外院行脑电图 检查示“高度失律？”，头颅CT 未见脑结构异常 及颅内钙化点，考虑“癫癎？”，予维生素B6 静 滴、肌注鲁米那及静推安定止惊治疗仍抽搐频繁， 于生后46 d 收入我院治疗。患儿喂养困难，体重 较出生体重下降20 g。入院体查：精神差，中度 营养不良，心肺腹未见异常，双下肢肌张力增高、 腱反射活跃、不能逗笑。辅助检查：V-EEG 结果 示高度失律，部分暴发- 抑制；头颅磁共振、血 尿代谢筛查、脑脊液常规及生化检查均未见异常， 血巨细胞病毒（CMV）IgM 及尿CMV-DNA 阳性。 诊断为癫癎、痉挛发作、大田原综合征。入院后 应用托吡酯抗癫癎治疗，剂量加至每日8 mg/kg 发作无好转，由于存在CMV 感染，未予应用 ACTH，建议行生酮饮食治疗，家长放弃治疗出院， 患儿于生后4 个月死亡。

另外10 例未发现该基因突变的新生儿难治 性惊厥患儿中婴儿痉挛症2 例，其中1 例经托吡 酯、左乙拉西坦、ACTH 治疗后已4 个月无临床 发作，脑电图有所改善，为界限性脑电图表现， 发育同同龄儿；大田原综合征患儿3 例，1 例转为 婴儿痉挛症，应用托吡酯、ACTH、生酮饮食治疗 抽搐仍频繁，1 例放弃治疗，1 例临床发作减少， 应用托吡酯、ACTH 抽搐未完全控制，3 例患儿均 存在发育落后；非综合征型的早发型癫癎脑病1 例，部分性发作，脑电图表现为高度失律，患儿 起病时即伴随发育落后，院外应用苯巴比妥治疗， 入院监测苯巴比妥血药浓度在有效范围内，予逐 渐减量并加用托吡酯患儿抽搐未控制，未同意用 ACTH；其它类型癫癎4 例，其中2 例为痉挛发作， 但脑电图无高度失律或暴发- 抑制表现，1 例脑 电图为高度失律，但仅表现为部分性发作，另外1 例脑电图为高度失律，部分暴发- 抑制，临床表 现为痉挛发作和部分性发作，单用一种抗癫癎药 物均未控制临床发作。 3 讨论

新生儿难治性惊厥的患儿中有相当一部分 病因不明，为临床诊治带来了很大的困难。本研 究尝试对不明原因的新生儿难治性惊厥患儿进行 STXBP1 基因突变的检测，初步探讨该类疾病与 STXBP1 基因突变的关系，为不明原因的难治性惊 厥患儿的病因诊断提供新的思路。

STXBP1 基因位于9 号染色体长臂，其遗 传方式为常染色体显性遗传。STXBP1 基因编 码的蛋白质为突触融合蛋白，对可溶性NSF （N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein,NSF,N- 乙 基马莱酰胺敏感因子蛋白）附着蛋白受体的形成、 钙通道感受器的敏感性和突触囊泡与突触前膜的快 速融合有调节作用，负责突触间神经递质的释放。 所以STXBP1 基因突变会引起神经递质释放的异 常，改变神经元的兴奋性，导致惊厥发作^{[ 7, 8, 9, 10 ]}。自 2008 年Saitsu 等^{[ 10 ]} 第1 次报道STXBP1 的基因突 变存在于大田原综合征的日本患儿中，现已发现 该基因突变与婴儿痉挛症、早发肌阵挛脑病、婴 儿游走性部分性癫癎等癫癎综合征、智力运动发 育落后和孤独症相关^{[ 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ]}。

结合既往文献报道，对存在STXBP1 基因突 变的难治性惊厥患儿的临床特点进行总结发现， 存在该基因的惊厥患儿起病早，大部分病例在生 后6 个月内起病；现有临床检查手段未发现病因； 大田原综合征和婴儿痉挛症是该基因突变引起的 两类常见的癫癎综合征；需应用多种抗癫癎药物 治疗；新生儿期惊厥不易控制，但经止惊药物积 极治疗，临床发作会在短时间内很快减少，多在2 岁以内抽搐停止，脑电图改善明显，极少数会在 停止抽搐多年后复发；起病时甚至起病前即伴有 发育落后，即使惊厥很快控制仍难以避免地出现 发育落后的表现；后期临床发作已控制，脑电图 恢复正常后，仍可出现一些行为异常的动作，如 肌张力异常、手足徐动、震颤、舞蹈样动作、啃 咬手指的刻板动作等^{[ 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15 ]}。而本研究重点讨论的 新生儿难治性惊厥患儿临床特点表现为新生儿期 起病，惊厥难以控制，病因不明，且多预后不良， 大田原综合征是起病时常见的癫癎综合征类型， 还有一部分患儿会在新生儿期后转变为婴儿痉挛 症，这些临床特点与前述文献所报道的部分临床 特点一致，故考虑存在对新生儿难治性惊厥患儿 进行STXBP1 基因突变检测的可能性。目前已发现 STXBP1 基因存在32 个突变类型，均为杂合突变， 尚未发现人群中的热点突变。20 个外显子除第1、 2、12、17、20 外显子外均有突变的报道，突变类 型包括错义突变、无义突变、剪切突变和缺失突变， 还有4 例患儿表现为染色体微缺失^{[ 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 18 ]}。

本研究发现的存在STXBP1 突变患儿的基因 位点与Milh 等^{[ 5 ]} 在2011 年发表的文章中报告1 例大田原综合征患儿一致。本患儿临床特点为典 型的大田原综合征表现，新生儿早期起病的难治 性惊厥，发作形式为痉挛发作，脑电图呈现暴发- 抑制的波形，并在起病初期就存在发育落后。但 文献报道存在该突变的患儿在应用止惊治疗后惊 厥得以缓解，而本例患儿的惊厥未控制。由于本 例患儿因放弃治疗死亡，不能对止惊药物的疗效 进行正确评估，故对于存在STXBP1 基因突变患儿 的特征性临床表现，尤其是对抗惊厥药物的反应 还有待继续研究。

目前与早发难治性癫癎相关的突变基因热点 研究除STXBP1 外，还有CDKL5 和ARX，对于这 两者的研究起步要早于STXBP1。这两个基因均位 于X 染色体短臂，X 连锁遗传使其发病率有性别差 异。CDKL5 突变主要累及女婴，也以新生儿期起 病的难治性惊厥为特点，但随年龄增加可伴有Rett 样表现，如啃咬手指的刻板动作、孤独症等^{[ 19, 20, 21, 22, 23, 24 ]}。 ARX 突变主要发生在男性患儿，患儿可伴有生殖 器的异常^{[ 24, 25, 26 ]}。对于不存在STXBP1 基因突变的新 生儿难治性惊厥患儿可以考虑进行CDKL5 和ARX 基因突变的检测，以发现可能存在的病因。

本研究对临床未找到明确病因的新生儿难治 性惊厥患儿进行STXBP1 基因突变的检测，并发现 1 例患儿存在该基因突变，其突变率和临床表现与 现有文献报道一致，为该类疾病的临床诊治和预 后判断提供了依据，同时为进一步深入研究提供 了新的思路。