女童性早熟发生的病因很多，环境污染的 影响受到越来越多的关注。双酚 A（bisphenol A, BPA）是环境内分泌干扰物中的一种，1993 年 Krishnan 首次提出 BPA 具有类雌激素样作用后 ^[1]， BPA 对人类生长发育的影响受到了广泛关注。 虽然美国政府将每日 50 mg/kg 暴露作为 BPA 的可观察到有害作用的最低剂量，每日 50 μg/kg 暴露作为人类 BPA 暴露“安全剂量”^[2]。但这仅 是成人暴露剂量，在儿童乃至婴幼儿 BPA“安全 剂量”尚不明确。文献报道 BPA 具有“U”效应^[3]， 即在一定的剂量范围内，剂量 - 效应曲线的斜率 可发生正负的转换。大剂量的 BPA 暴露（每日 >50 mg/kg）可能导致肝、肾功能或者体重改变 ^[4]， 低剂量 BPA 暴露对人类的影响尚不清楚，故 BPA 低剂量暴露对儿童性发育的影响需进一步探讨。

青春期是由下丘脑 - 垂体 - 性腺轴启动引起，下 丘脑 Kisspeptin-Kiss-1R-GnRH 信号系统的激活， 雌激素受体的表达增多并反馈调节GnRH 神经元， 再通过靶器官的雌激素受体（estrogen receptor， ER），从而启动青春发育 ^[5]，环境内分泌干扰物 可能干扰此过程。本研究拟通过不同剂量 BPA 干 预新生大鼠，了解其是否可能引起大鼠青春期启 动提前，如提前是否与下丘脑 Kiss-1 基因表达改 变相关及对外周性腺 ER 表达的影响。 1　材料与方法 1.1　主要试剂

BPA（ 美 国 Sigma 公 司），E₂（ 美 国 Sigma 公司），玉米油（金龙鱼，益海嘉里投资有限公 司），无水乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公 司）。DEPC（上海华舜生物工程公司）；随机引 物（上海生工生物工程公司合成）；Trizol、RNase Inhibitor（Invitrogen 公司）；RNase Inhibitor、M-MLV、 dNTP MIX（10mM）（Promega 公司）；设计引物 采用 Primer 5 软件，经 GenBank Blast 进行同源检 索后合成。引物由上海生工生物工程公司合成。 实验药物溶剂为无水酒精：玉米油以 1 : 9 比例制 成的混合溶液^[6] 。E₂与BPA均溶于上述混合溶剂中， E₂组溶液化学物浓度为 2×10^-4 g/mL，低剂量 BPA 组溶液化学物浓度为 5×10^-6g/mL，中剂量 BPA 组 溶液化学物浓度为 1×10^-5g/mL，高剂量 BPA 组溶 液化学物浓度为 5×10^-5g/mL。 1.2　试验动物及饲养条件

清洁级雌性 Spuague-Dawley（SD）大鼠 8 只， 体重 150 g 左右；雄性 4 只，体重 120 g 左右，购 自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养环境 为昼夜 12 h 交替，室内温度控制在 18~22℃之间， 湿度 50%~60%，食物和水自由摄取。新生仔鼠母 乳喂养，生后 21 d 断奶。1.3　动物分组和观察指标

雌雄鼠分开喂养，适应性饲养至雌雄鼠均约 200 g，按雌雄比 2 : 1 合笼交配，每日进行阴道涂 片检查，查到精子存在即为妊娠，雌雄鼠分笼。 孕鼠单独喂养，每日观察孕鼠情况。记录分娩时间， 设分娩当天为仔鼠生后 0 d（postnatal day 0,PND 0）。仔鼠以交叉培育方式喂养，每只母鼠喂养 12 只仔鼠，雌雄比为 1 : 1。为排除大鼠新生儿期玉米 油与无水酒精混合物暴露对机体生长发育的影响， 本实验特设溶剂组。48 只雌性仔鼠随机分为 6 组： 空白对照组（只观察不干预）、溶剂组（于 PND 0~6 皮下注射上述混合溶剂，约 0.05 mL/ 只）、E₂ 组（PND 0~6 皮下注射 E₂组溶液，约 0.05 mL/ 只）、 低剂量 BPA 组（于 PND 0~6 皮下注射低剂量 BPA 溶液约0.005 mL/g，即25 μg/kg）、中剂量BPA 组（于 PND 0~6 皮下注射中剂量 BPA 溶液约 0.005 mL/g， 即 50 μg/kg）、高剂量 BPA 组（于 PND 0~6 皮下 注 射 高 剂 量 BPA 溶 液 约 0.005 mL/g，即 250 μg/ kg）。给药期间每天称重，根据体重调整药量。 仔鼠在 PND 21 断奶，断奶后每日观察雌性仔鼠是 否阴道开口并记录阴道开口时间（vaginal opening day,VOD）。在阴道开口当天颈椎脱臼法处死仔鼠， 称重，立刻取出卵巢、下丘脑，称取其湿重后投 入液氮，-80℃低温保存用于 RT-PCR 检测。下丘 脑取材范围为头侧至视交叉前 3 mm、尾侧至乳头 体、两侧至下丘脑沟，深度为 3 mm。卵巢取材范 围为与子宫角紧密相连的两侧肾脏外下方呈淡粉 色的卵巢，体积约为 3 mm×4 mm×4 mm 大小， 仔细剥离其周围的脂肪组织，双侧对称剥离。 1.4　脏器系数计算

取出下丘脑及卵巢后，迅速称取其湿重，计 算下丘脑脏器系数（下丘脑湿重 / 体重）。卵巢脏 器系数（双侧卵巢湿重 / 体重）。 1.5　RT-PCR 检测 1.5.1　 总 RNA 的提取

　　TRIzol 一步法提取总 RNA。紫外分光光度计测定 RNA 浓度及纯度， A260/A280 比值在 1.8~2.0 之间。1.5.2　 合成 cDNA

　　按 42℃，60 min ；95℃， 5 min 将 RNA 逆转录成 cDNA，-20℃保存。1.5.3　 PCR 反应

　　引物序列为Kiss-1 上游引 物：5'-GATCTCGCTGGCTTCTTGGC-3'，下游引 物：5'-GGACTGTTGGCCTGCGGGTT-3'（产物长度 112 bp）。ERα 上游引物：5'-TGAAGCACAAGCGTCAGAGA-3'，下游引物：5'-CGTAGCCAGCAACATGTCAA-3'（产物长度 501 bp）。ERβ 上游引物： 5'-GAA-GCTGAACCACCCAATGT-3'，下游引物： 5'-CAGTCCCACCATTAGCACCT -3'（产物长度 210 bp）。内参上游引物：5'-CCCA TCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'（ 产 物 长 度 150 bp）。 反 应 条 件 为： 95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃， 30 s，72℃收集荧光，共 50 个循环。 1.6　统计学分析

采用参照基因的 ΔCT 法计算目的基因 mRNA 的相对表达量，用相对定量法计算各基因 mRNA 表达水平（Q），直接用管家基因来校正样品初始 量，定量公式为：Q ＝ ^{2-△△ Ct}，△△Ct＝(待测 样品目的基因平均 Ct 值 - 待测样品管家基因平均 Ct 值 )-( 标准品目的基因平均 Ct 值 - 标准品管家 基因平均 Ct 值 )，Ct 值为每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。采用 SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分析。计量资料 采用均数 ± 标准差（x±s）表示，多组间比较用 单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用 SNK 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　动物一般情况

各组间PND 0 体重差别无统计学意义 （F=0.264，P=0.930）；各组间 PND 6 体重差异亦 无统计学意义（F=0.063，P=0.997）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1各组仔鼠 PND 0 和 PND 6 体重的比较　（x±s,g）

表 1各组仔鼠 PND 0 和 PND 6 体重的比较　（x±s,g）

E₂组 VOD 较其余各组均提前，差别具有统计 学意义（P<0.05）；中、高剂量 BPA 组 VOD 较对 照组、溶剂组、低剂量 BPA 组提前，差异有统计 学意义（P<0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组 VOD 比较　（x±s,d）

表 2 各组 VOD 比较　（x±s,d）

各组下丘脑脏器系数的差异无统计学意义 （F=0.231，P=0.947），见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 下丘脑、卵巢脏器系数比较　（x±s,％）

表 3 下丘脑、卵巢脏器系数比较　（x±s,％）

E₂组卵巢脏器系数较其余各组降低明显，差 异有统计学意义（P<0.05），见表 3。 2.5　 各组下丘脑 Kiss-1 mRNA 相对表达量比较

E₂组下丘脑 Kiss-1 mRNA 相对表达量较其余 各组降低明显，差异有统计学意义（P<0.05），见 表 4。

表 4(Table 4)

表 4下丘脑 Kiss-1 mRNA 相对表达量比较　（x±s）

表 4下丘脑 Kiss-1 mRNA 相对表达量比较　（x±s）

各组间卵巢 ERα mRNA 相对表达量差异无统 计学意义（F=1.365，P=0.257）；E₂ 组卵巢 ERβ mRNA 相对表达量较其余各组降低明显，差异有 统计学意义（P<0.05）。见表 5。

表 5(Table 5)

表 5 卵巢 ER mRNA 相对表达量（x±s）

表 5 卵巢 ER mRNA 相对表达量（x±s）

青春期启动一般认为是由下丘脑 - 垂体 - 性 腺轴启动引起，即性激素通过其受体正反馈作用 于下丘脑导致Kiss-1 基因编码产物 kisspeptin 与 其受体 GPR54 结合，引起促性腺激素释放激素 （GnRH）的表达增加，刺激垂体前叶分泌促性腺 激素、黄体生成素（LH）及卵泡刺激素（FSH）， 引起外周性腺甾体类激素分泌增多，促进外周性 腺发育。由此可知Kiss-1 基因在青春期启动中发挥重要作用^{[7, 8]}。ER 主要有两种类型—α 受体 （ERα）和 β 受体（ERβ），卵巢 ERα 主要作 用是引起卵泡细胞增殖，ERβ 是性激素在卵巢组 织上发挥作用的重要途径^[9]。脏器系数又称脏体比， 是实验动物某脏器的重量与其体重之比值。正常时 各脏器与体重的比值比较恒定。染毒后受损脏器重 量可以发生改变，故脏器系数也随之而改变^[10]。

Navarro 等 ^[11] 研究结果显示，E₂在 PND 0 单 次暴露和 BPA 以每只 100 μg、500 μg 剂量在 PND 1~5 d 染毒大鼠即可导致PND 30 时大鼠下丘脑 Kiss-1 mRNA 水平下降。有研究显示在 PND 5 至 PND 11，经母乳染毒 BPA 可引起雌性 SD 大鼠在 PND 70 时其卵巢 ERα、ERβ 表达下降 ^[12]，推测 BPA 在上述剂量及作用时间条件下，可影响大鼠 下丘脑 Kiss-1 基因及卵巢 ERα、ERβ 表达。但 上述 BPA 剂量均较大，正常生存环境中较难发生， 目前对 BPA 少量暴露对青春发育及外周性腺影响 的研究较少，因此本研究着重关注新生大鼠少量 BPA 暴露对其青春期启动及下丘脑 Kiss-1 基因、 卵巢 ER 表达影响。

0~6 月婴儿若使用塑料奶瓶喂养，其 BPA 暴 露量 95% 参考值范围上限约为每日 4.5 μg/kg ^[13]。 按照等效药物剂量换算，大鼠药物剂量约为人类 5~6 倍 ^[14]。因此本研究中采用的 BPA 低剂量约为 每日 4.5 μg/kg 的 6 倍，即 25 μg/kg，中剂量选择 人类暴露“安全剂量”（每日 50 μg/kg），高剂 量选择高于人类“安全剂量”5 倍的剂量（每日 250 μg/kg），旨在模拟人类在婴儿期可能存在的 潜在 BPA 暴露。将 E₂暴露作为可以引起大鼠阴道 VOD 提前和卵巢发育异常的阳性对照 ^[6]。

本研究结果显示，在干预起始及结束当天测 仔鼠体重，各干预组与对照组相比未见明显差异， 可推测本实验所选用药物剂量未对动物基本生长 产生影响。溶剂组各实验结果与对照组均无明显 差异，可排除溶剂本身对大鼠青春期启动及卵巢 发育的影响。而各干预组与对照组的下丘脑脏器 系数差异无统计学意义，说明新生儿期 BPA、E₂ 暴露未对下丘脑重量产生明显影响。

本研究显示，E₂组、中、高剂量 BPA 组与对 照组相比 VOD 提前，其中 E₂组最早，此结果与 Losa-Ward 等 ^[6] 的研究基本一致。说明新生儿期中、 高剂量 BPA 暴露可以引起大鼠 VOD 提前。下丘脑Kiss-1 基因 RT-PCR 结果显示，青春期启动时，E₂ 组的 Kiss-1 mRNA 表达水平较对照组明显降低，推 测其原因可能是大鼠新生儿期 E₂暴露后，其下丘 脑 Kiss-1 基因神经元应对性激素正反馈通路遭到破 坏导致^[15] 。虽 然 E₂组的 Kiss-1 mRNA 表达降低，中、 高剂量 BPA 暴露 Kiss-1 mRNA 表达水平与对照组 相比无明显差异，但中、高剂量 BPA 组及 E₂组 VOD 均提前，提示大鼠 VOD 提前可能与下丘脑中 对 GnRH 有抑制作用的基因破坏相关，而非 Kiss-1 表达增加导致^[6]，该结果有待进一步实验验证。

本研究中E₂ 组卵巢脏器系数及卵巢ERβ mRNA 较对照组明显下降，但 BPA 组与对照组相 比无明显差异。因卵巢发育及其 ER 表达与外周 血浆中FSH、LH、外周性腺甾体类激素相关。 而 Kiss-1 编码合成的 kisspeptin 与其受体 GPR54 结合可以引起 GnRH 分泌增加，从而进一步导致 FSH、LH 分泌增加，甾体类激素分泌增多，外周 性腺发育^{[7, 8]} 。因此可以推测由于本研究中 E₂组 下丘脑 Kiss-1 表达较对照组明显下降，导致其 GnRH、LH、FSH 也随之下降，甾体类激素分泌 减少，而卵巢 ERα 主要作用仅是引起卵泡细胞增 殖，ERβ 才是性激素在卵巢组织上发挥作用的重 要途径^[9] ，因此 E₂ 组卵巢脏器系数及卵巢 ERβ mRNA 较对照组明显下降。根据 E₂组下丘脑 Kiss-1 mRNA 及卵巢脏器系数、卵巢 ERβ mRNA 均下 降，可推测新生儿期高浓度 E₂暴露可对雌性大鼠 下丘脑及卵巢发育造成严重影响。本研究中，中、 高剂量 BPA 组与对照组相比，VOD 时间提前，但 下丘脑、卵巢脏器系数及下丘脑 Kiss-1 mRNA、卵 巢 ER mRNA 与对照组相比无差异，可知新生儿期 每日 50 μg/kg、250 μg/kg BPA 持续暴露可以引起大 鼠 VOD 提前，但并没有对下丘脑 Kiss-1 基因表达 及外周卵巢 ERα、ERβ 表达产生明显影响。可 以推测新生大鼠每日 50 μg/kg、250 μg/kg BPA 暴 露引起 VOD 提前可能不是通过影响下丘脑 Kiss-1 基因表达变化来实现，且上述两种剂量 BPA 暴露 未对大鼠下丘脑 Kiss-1 基因主导的性发育产生严 重影响；而更小剂量（每日 25 μg/kg）BPA 暴露不 会引起大鼠 VOD 提前 。