支气管哮喘是以气道高反应性和嗜酸性粒细 胞（eosinophils,EOS）性气道炎症为特征的免疫紊 乱性疾病，Thl/Th2 失衡、Th2 细胞功能亢进是支 气管哮喘的重要免疫学发病机制^{[ 1 ]}。在哮喘中， Th2 细胞通过释放IL-5、lL-4、IL-6、IL-9、IL-13 以及粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子（granuloeyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）等多 种细胞因子和趋化因子而促进EOS的聚集和活化、 IgE 的形成，形成气道慢性炎症，气道反应性增 高，从而导致了哮喘发作^{[ 2 ]}。甲磺司特（suplatast tosilate,IPD）是一种新型的选择性Th2 细胞因子抑 制剂。国外有关IPD 的临床应用证实IPD 能降低 哮喘受试者（包括激素依赖性哮喘、咳嗽变异型 哮喘）症状评分、改善肺功能，减少β₂ 受体激动 剂的用量，具有“节约激素”的作用^{[ 3 ]}。但其具体 作用机制值得进一步探讨。本研究拟通过观察IPD 早期干预与晚期干预后肺组织IL-5 mRNA 表达的 变化，了解该药物对免疫反应的致敏阶段与激发 阶段的影响。 1 材料与方法 1.1 动物分组和试剂用品

4周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50 只， 体重200±20 g，SPF 级（湖南农业大学动物部）， 随机分为5 组，每组10 只：对照组、模型组、布 地奈德（BUD）组、IPD（A）组和IPD（B）组。

试剂用品包括卵清蛋白（OVA，美国 Sigma 公司）；甲磺司特颗粒（北京兴德通医药科技有 限公司）；IL-5 酶联免疫吸附试剂盒（美国RD 公 司）；Trizol、IL-5 引物及GAPDH 引物（Invitrogen 公司）。 1.2 动物模型的制备

除对照组以外的4 组大鼠分别于第1 天和 第8 天腹腔注射10％ OVA 混合液1 mL（含OVA 100 mg、氢氧化铝100 mg 及灭活百日咳杆菌苗 5×109 个作为免疫佐剂）致敏。2 周后再进行激 发，2％ OVA 泵雾化吸入，10 min/ 次，每日1 次， 连续7 d，构建大鼠哮喘模型。对照组致敏和激发 均以生理盐水代替。BUD 组每次激发前用BUD 溶 液0.64 mL/kg（含BUD 0.32 mg）^{[ 4 ]} 加生理盐水至 2 mL 泵雾化吸入，IPD（A）组和 IPD（B）组参照 文献^{[ 5 ]} 的剂量分别从致敏（实验第1 天）和激发 （实验第15 天）阶段开始予IPD [50 mg/(kg · d)] 灌 胃。激发后大鼠出现哮喘症状如躁动不安、 咳嗽、 呼吸急促、紫绀等，证实模型制作成功。其中IPD （A）组大鼠1 只灌胃过程中因灌胃针误入气管而 窒息死亡。 1.3 肺组织苏木精- 伊红染色

各组大鼠于末次激发24 h 内（即第21 天）， 腹腔注射10％水合氯醛4 mL/kg 麻醉，心脏采血 后处死大鼠，取右肺上叶浸泡于4% 多聚甲醛中 固定，脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋、切片 4 μm，用苏木精- 伊红（HE）染色常规病理组织 学检查，观察支气管及肺泡周围炎症细胞浸润、 小血管管壁、支气管平滑肌改变及支气管壁周围 的EOS 浸润等情况。 1.4 肺泡灌洗液炎性细胞计数及EOS 百分比

末次激发24 h 内处死大鼠后，充分暴露气管、 左支气管、左肺，在环状软骨上缘小心切开气管， 用10 mL 注射器针头制成灌洗针向肺组织方向插入 后结扎并固定，匀速注入3 mL 生理盐水至肺尖膨 胀，反复抽洗3 次，回收灌洗液并计量，回收率大 于80%，采集的肺泡灌洗液（BALF），一部分用 于BALF 炎性细胞总数测定，部分离心 10 min（4℃， 3 000 r/min），上清液用于细胞因子IL-5 测定；取 少许离心沉渣涂片经瑞氏染色，镜下计数200 个 细胞，计数EOS 百分比（在高倍显微镜下计数至 少200 个除红细胞和上皮细胞外的有核细胞总数）。 1.5 肺组织IL-5 mRNA 含量的测定

用逆转录- 聚合酶链式反应（RT-PCR） 法，取冷冻的右肺中央组织约50 mg，加入1 mL Trizol 提取总RNA，紫外线分光光度法测定RNA 纯度和含量。取1 μg RNA 在 oligo dT（18） 和 dNTP mixture 存在的情况下进行逆转录反应合 成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。 由美国Invitrogen 公司完成IL-5 引物序列、大鼠 GAPDH 内参引物序列合成。大鼠IL-5 引物序列： 上游5'-TGCTTCTGTGCTTGAACGTTCTAAC-3'，下 游5'-TTCTCTTTTTGTCCGTCAATGTATTTC-3'，预 期扩增产物长298 bp。大鼠GAPDH 内参引物序 列: 上游5'-CAAGGTCCATGACAACTTTG-3'，下游 5'-GTCCACCCTGTTGCTGTAG-3'，预期扩增产物长 496 bp。PCR 反应条件：94℃ 预变性4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30 个循环，72℃ 延伸 5 min，对扩增后的产物各取10 μL 进行琼脂 糖凝胶电泳（Goodview 显色），电泳后紫外灯光 下观察结果并照相，经凝胶成像分析系统扫描， 进行面积灰度扫描，以密度代表其表达量，计算 出目的基因的相对含量。目的基因的相对含量= 目的基因的密度/GAPDH 基因的密度。 1.6 IL-5 含量的测定

采用大鼠IL-5 ELISA 检测试剂盒检测BALF 中IL-5 含量，按照试剂说明书进行操作，根据光 密度值计算出标本中所含因子的含量。 1.7 统计学分析

数据使用SPSS 16.0 软件进行统计学分析，计 量资料以均数± 标准差（±s）表示，组间比较 采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意 义。 2 结果 2.1 病理组织学改变

肺组织切片HE 染色后，对照组支气管管腔 规则、黏膜上皮整齐，管腔内无炎性渗出物及黏 液栓，管壁无增厚，气道周围未见明显炎性细胞 浸润。模型组支气管周围可见大量炎症细胞浸润， 包括：EOS、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等； 炎性细胞主要在支气管黏膜下层及黏膜外层、肺 泡壁和小血管周围等处浸润，肺间质及肺泡腔内 可见EOS，支气管内可见黏液栓，气道上皮有损伤、 断裂，基底膜稍增厚且形态不规则，平滑肌有轻 度的增生。与模型组相比，IPD 组气道周围炎症明 显减轻，气道周围炎症细胞浸润、气道分泌物减 少，支气管壁增厚及上皮细胞脱落现象明显改善。 BUD 组气道周围炎症细胞浸润明显减少，气道分 泌物及上皮细胞脱落少见，气道周围炎症较模型 组明显减轻。而BUD 组、IPD（A）组及IPD（B） 组之间气道炎症改变相似。见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 各组肺组织病理变化（HE 染色，×100） A：对照组，支气管管腔规则、黏膜上皮整齐，管腔内无炎性渗 出物及黏液栓，气道周围未见明显炎性细胞浸润；B：模型组支气管周围可见大量炎症细胞浸润，支气管内可见黏液栓，基底 膜稍增厚且形态不规则；C：BUD 组，气道周围炎症细胞浸润明显减少，气道分泌物及上皮细胞脱落少见；D：IPD（A）组， 气道周围炎症明显减轻，气道分泌物减少，支气管壁增厚及上皮细胞脱落现象较模型组明显改善；E：IPD（B）组，与IPD（A） 组类似，气道周围炎症较模型组明显改善。

模型组BALF 中炎性细胞总数及EOS 百 分比较对照组明显增高，差异均有统计学意义 （P<0.05）；BUD 组、IPD（A）组和IPD（B）组 炎性细胞总数及EOS 百分比较模型组明显降低， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。其中，IPD（B） 组与IPD（A）组比较差异无统计学意义（P > 0.05）， 但与BUD 组差异有统计学意义（P < 0.05），IPD（A） 组与BUD 组差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组BALF 中炎性细胞总数及EOS 百分比比较 （±s） 注：a 示与对照组比较，P<0.05；b 示与模型组比较， P<0.05；c 示与BUD 组比较，P<0.05。

表 1 各组BALF 中炎性细胞总数及EOS 百分比比较 （±s）

模型组BALF 中IL-5 的含量，肺组织IL-5 mRNA 表达明显高于对照组（P<0.01），差异有统 计学意义；与模型组比较，BUD 组、IPD（A）组 和IPD（B）组均明显降低（P<0.05），差异有统 计学意义。其中，IPD（B）组与IPD（A）组无统 计学差异（P<0.05），但与BUD 组有统计学差异 （P<0.05），IPD（A）组与BUD 组无统计学差异 （P>0.05）。见表 2，图 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠BALF 中IL-5 含量和肺组织IL-5 mRN 的表达量 （±s） 注：a 示与对照组比较，P<0.05；b 示与模型组比较， P<0.05；c 示与BUD 组比较，P<0.05。

表 2 各组大鼠BALF 中IL-5 含量和肺组织IL-5 mRN 的表达量 （±s）

图 2

Fig. 2

图 2 各组大鼠肺组织IL-5 mRNA 的RT-PCR 产物电泳图

目前，支气管哮喘的发病机制还不十分清楚， 可能与遗传、免疫、环境等有关。在免疫学上， 一般将哮喘的发病过程分为3 个阶段：初期为致 敏阶段，包括过敏原刺激、T 细胞激活、IL-4 产生、 IgE 合成和效应细胞释放介质；第2 期为慢性过敏 性炎症阶段，以Thl/Th2 细胞比例失衡、IL-5 增多 及EOS 活化、增多和聚集为特征，在哮喘发作过 程中起主要作用；第3 期以气道重构为特征，是 难治性支气管哮喘的重要原因^{[ 6 ]}。因此，早期干预 和治疗是防止哮喘炎症发展的有效措施，对防止 气道重构尤为重要。IPD 是近年新开发治疗支气管 哮喘的一种药物，国外研究证实，IPD 是一种新型 的选择性Th2 细胞因子抑制剂，能抑制EOS 炎症， 进而降低IgE 抗体滴度，抑制肥大细胞脱颗粒和炎 症介质的释放，降低气道高反应性，改善气道炎 症^{[ 7 ]}。另外IPD 能阻断单核细胞向树突状细胞（DC） 的分化、成熟和功能，促使Thl 反应增强^{[ 8 ]}。其作 用靶点可能位于EOS 表面的氯离子通道^{[ 9 ]}，使该 药的作用机制受到了一些争论，因此，有必要对 IPD 的作用进行深入研究。本研究观察IPD 早期和 晚期干预对哮喘大鼠肺组织IL-5 mRNA 表达量、 BALF 中IL-5 的含量、BALF 中炎性细胞总数与 EOS 百分比的变化，发现模型组大鼠BALF 中IL-5 的含量增加及肺组织IL-5 mRNA 表达增强，经 IPD 早期和晚期干预后，其肺组织IL-5 mRNA 的 表达显著降低，BALF 中IL-5 含量下降，说明IPD 治疗哮喘的重要机制之一是通过抑制局部肺组织 IL-5 基因转录，减少IL-5 的生物合成，进而抑制 IL-5 对EOS 在气道的浸润、聚集和活化，降低气 道高反应性（airway hyperresponsiveness,AHR）， 从而减轻哮喘气道炎症。

同时，本研究还采用临床上常用的吸入激素 BUD 泵雾化吸入作为阳性对照，将IPD 与BUD 的疗效相比较，发现BUD 同样能降低哮喘大鼠 BALF 中IL-5 的含量，抑制肺组织IL-5 的基因转录， 与IPD 有类似的作用。罗光伟等^{[ 10 ]} 通过建立豚鼠 哮喘模型，发现地塞米松能抑制IL-5 基因转录， 进而抑制IL-5 对EOS 的聚集和活化，从而发挥其 抗气道炎症的作用，本研究结果与之一致。临床 上大多数患者已经呈Th2 优势反应，给予IPD 干 预能否逆转已经确立的Th2 优势反应的研究就显 得尤为重要。因此，本研究还设立了（晚期干预组） IPD（B）组，即在OVA 激发的第1 天（实验第15 天） 开始予IPD 灌胃干预。结果表明晚期给予IPD 也 可以抑制肺组织IL-5 的基因转录，降低BALF 中 IL-5 的含量，降低BALF 中炎性细胞总数，并且抑 制外周血EOS 的聚集。因此，本研究提示IPD 对 哮喘不仅有预防作用而且有治疗作用，为IPD 的 临床应用提供了进一步的理论依据。