出生缺陷（birth defect）是指存在于婴儿或 出生前的胚胎发育紊乱引起不同器官的结构性畸 形^[1]。美国报道最常见的出生缺陷有先天性心脏病 （CHD）、神经管缺陷（NTD）及颅面畸形等，其 中包括带或不带腭裂的唇裂（CL/P）和单纯的腭裂 （CPO）^[2]。1987 年中国945 所医院出生缺陷调查 结果表明，全国住院围产儿出生缺陷发生率为131/ 万，其中以山西省最高（204/ 万）^[3]。2002~2004 年北大人口所流行病学在我国山西发现出生缺陷 发生率为537.2/ 万，常见的类型为无脑畸形（Ane）、 CHD、脊柱裂（SB）、先天性脑积水（Hyd）和脑 膨出(Enc)^[4]。而出生缺陷除了单发外，部分表现 为复杂畸形^{[5, 6]}。但是他们是否存在发病的共同形 态学基础或者共同分子机制，目前不能十分确定。

目前研究表明，遗传和环境因素都参与了出 生缺陷的发生^[1]。叶酸在维持胚胎正常发育方面起 着非常重要的作用^[2]，人类叶酸缺乏可引起多种出 生缺陷的发生率升高^[7]。动物孕期叶酸缺乏可导致 流产、死产及子代多发畸形^{[8, 9]}。研究表明孕期补 充叶酸可以预防NTD 和其他先天畸形的发生^[10]。

叶酸参与核苷酸的合成和甲基转移反应，对 DNA 和蛋白质的甲基化修饰非常重要。研究表明 叶酸和同型半胱氨酸代谢途径相关的基因单核苷 酸多态性（SNP）位点与出生缺陷相关^{[11, 12, 13, 14]}。其中 常见的包括5,10 甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR） SNP 位点rs1801133（c.677C>T）和蛋氨酸合成酶 还原酶（MTRR）SNP 位点rs1801394（c.66A>G）。 研究表明rs1801133 与唇腭裂、NTD 及CHD 等 相关^{[11, 12, 15, 16, 17, 18]}，rs1801394 与CHD 及NTD 相 关^{[13, 14, 19]}。而这些畸形来源于胚胎早期的不同胚层，以往文献均从单个表型研究叶酸与疾病的相 关性，对于单个病例同时具有来源于多个器官的 畸形的研究少见报道，因此本研究拟研究是否多 发畸形的发生与叶酸相关，进一步探讨rs1801133 和rs1801394 与胚胎发育的某个胚层相关。

病例组为中国山西省因死胎或畸形引产的出 生缺陷胚胎250 例，标本库的建立见本课题组以 往文献^[20]。已登记信息的孕妇由当地经过培训的 临床医生经B 超检查确诊，然后在数据库中注册。 在250 例出生缺陷病例中包括CHD、NTD 和颅面 畸形等复杂畸形，胎龄均为13 周以上。另选取 420 例相关地区内健康受试者作为正常对照。本研 究通过首都儿科研究所伦理委员会批准，并获得 父母知情同意。

选择病例组和对照组肌肉组织提取基因组 DNA，用血液和组织DNA 提取试剂盒（QIAGEN， 德国）提取，操作按照说明书进行。 DNA 的浓度 和纯度通过260 nm 和280 nm 吸光值进行测定。 SNPs 利用SNaPshot 分析（ABI）基因分型。简言之， 基因组DNA，通过使用表 1 中所列的引物扩增。 然后纯化，得到模板，其中包括靶SNP 位点。根 据说明书，延伸引物（表 1）和多重快照加入到模 板和热循环反应完成。随后基因在ABI3730（GE， 美国）自动测序仪上进行分型样品的运行，并通 过Peakscan 软件进行分析。

表 1(Table 1)

表 1 MTRR rs1801394 与MTHFR rs1801133 的SNP 信息

表 1 MTRR rs1801394 与MTHFR rs1801133 的SNP 信息

正常对照的Hardy-Weinberg 平衡（HWE）由 χ2 检验测试，OR 值和95％置信区间（CI）之间的 关联的计算与调整使用SNPStats 网站进行年龄校 正后的logistic 回归分析（http://bioinfo.iconcologia. net/snpstats/start.htm）。对每个SNP 位点进行共显 性模式，显性模式，隐性模式和对数模式的分析。 并采用SPSS 15.0 软件（SPSS） 进行统计分析， P<0.05 为差异有统计学意义。

本研究根据2010 公布的疾病和有关健康问 题的国际统计分类第10 次修订（ICD-10）版本 （图 1A）为病例组的出生缺陷分型。根据表型发 育来源分成外胚层、中胚层和内胚层（图 1B）。 并将具有2 个或多个不相关的主要结构性畸形、 不能由1 个基本综合征来解释的定义为复杂先天 畸形^{[5, 21]}。本研究病例组单个样本最多存在8 种畸形。

图 1 来源于3 个胚层的出生缺陷分型注：A 图表示正常情况下3 个胚层来源的组织和器官；B 图表示来源于不同胚层的畸形分类，分为外胚层、内胚层和中胚层。Ane: 无脑儿；SB：脊柱裂；Enc：脑膨出；Hyd：先天性脑积水；Cra：颅面畸形；Cle：唇裂和腭裂；CMAG：肾上腺先天畸形；CMRS：呼吸系统先天畸形；CHD：先心病；CMSBT: 脊柱和骨性胸廓的先天畸形；CFS：短颈综合征；LM：四肢畸形；CMS:脾脏先天畸形；CMUS：泌尿系统先天畸形；Cel：腹裂；CMRS：呼吸系统先天畸形；SMDS：消化系统先天畸形。

为研究SNP 位点rs1801394 和rs1801133 是 否与出生缺陷和胚层发育相关，用SNaPshot 方 法对这2 个SNP 位点进行基因分型。结果表明， rs1801394 对照组病例共401 例，其中GG 基因型 为68 例（17.0%）。GG 基因型在Ane 中占7.0%， 在SB 中占7.4%，在Hyd 中占7.3%，在Enc 中 占4.2%，在四肢畸形（LM）中占3.0%，在先天 性呼吸系统畸形（CMRS） 中占7.5%（ 表 2）。 rs1801394 的隐性纯合的OR 和95％ CI 在Ane 样 本中为0.37（0.17~0.79），SB）为0.39（0.21~0.72）， Hyd 为0.39（0.17~0.87），Enc 为0.21（0.07~0.70）， LM 为0.15（0.04~0.63）和CMRS 为0.40（0.19~0.86）（表 3）。表明在隐性模型下，携带GG 基因型 的个体发生先天缺陷的概率低。提示MTRR 的 rs1801394 隐形纯合是复杂先天畸形的保护性因素。

表 2(Table 2)

表 2 MTRR rs1801394 在各畸形分型和对照中的基因型分布 [n(%)]

表 2 MTRR rs1801394 在各畸形分型和对照中的基因型分布

表 3(Table 3)

表 3 病例组和对照组 MTRR rs1801394 多态性分析

表 3 病例组和对照组 MTRR rs1801394 多态性分析

rs1801133 的CC 基因型为85 例（21.1%）。 CC 基因型在Ane 中占11.4%，在SB 中占14.3%， 在短颈综合征（CFS）中占8.2%，在CMRS 中占 12.3%（表 4）。rs1801133 隐性纯合的OR 和95％ CI 在Ane 中为0.48（0.26~0.90），在SB 为0.62 （0.39~1.00），在CFS 中为0.33（0.12~0.95）， 在CMRS 中为0.52（0.28~0.98）（表 5）。表明在 隐性模型下，携带CC 基因型的个体发生先天缺陷 的概率低。提示MTHFR 的rs1801133 隐性纯合是 复杂先天畸形的保护性因素。

表 4(Table 4)

表 4 MTHFR rs1801133 在各畸形分型和对照中的基因型分布 [n(%)]

表 4 MTHFR rs1801133 在各畸形分型和对照中的基因型分布

表 5(Table 5)

表 5 病例组和对照组 MTHFR rs1801133 多态性分析

表 5 病例组和对照组 MTHFR rs1801133 多态性分析

rs1801394 和rs1801133 与多种胚层来源不同 的先天性畸形相关，提示rs1801394 和rs1801133 可能与胚胎早期发育相关，胚胎早期发育为3 个 胚层（图 1B），多发畸形可能起因于一个共同的 早期营养因素叶酸的缺乏。因此，本研究进行了 rs1801394 和rs1801133 与3 个胚层（图 1B）风险 的关联分析。结果表明，rs1801133 CC 基因型在对 照中的比例是21.1%，在外胚层、中胚层和内胚层 中分别是15%，16.3%，12.3%。而rs1801394 GG 基因型在对照、外胚层、中胚层和内胚层中的比 例分别为17%、7%、5.4% 和7.5%（表 6）。在内、 外胚层组，rs1801133 的隐性纯合子OR 和95％ CI 分别为0.52（0.28~0.98） 和0.67（0.44~1.02）， 其中rs1801133 在外胚层缺陷组中隐性模式比较P 值为0.057，经对数加法模型的校正分析，其OR 和95% 可信区间为0.77（0.61~0.97），P 值为0.024，差异有统计学意义。而rs1801394 的隐性 纯合子OR 和95％ CI 分别为0.37（0.21~0.64）和 0.40（0.19~0.86）。在中胚层组只有rs1801394 的 隐性纯合子比值比（OR）和95％可信区间为0.28 （0.13~0.60）（表 7）。提示rs1801133 隐性纯合 作为保护性因素与内、外胚层来源复杂先天畸形 相关，rs1801394 隐性纯合作为保护性因素与3 个 胚层来源的先天畸形相关。

表 6(Table 6)

表 6 MTRR rs1801394 和MTHFR rs1801133 在对照和 3 个胚层来源的畸形中的基因型分布 [n(%)]

表 6 MTRR rs1801394 和MTHFR rs1801133 在对照和 3 个胚层来源的畸形中的基因型分布

表 7(Table 7)

表 7 MTRR rs1801394 与MTHFR rs1801133 与三胚层缺陷之间的相关性

表 7 MTRR rs1801394 与MTHFR rs1801133 与三胚层缺陷之间的相关性

本研究发现，在中国山西复杂先天畸形人群 中，MTRR GG 型和MTHFR CC 型是复杂先天畸形 的保护性因素。MTHFR 的rs1801133 和MTRR 的 rs1801394 隐性纯合都是外胚层来源和内胚层来源 器官发育的保护性因素。而MTRR 的rs1801394 隐 性纯合是中胚层来源器官发育的保护因素。

本研究提示在人类样本中，出生缺陷与环 境营养因素叶酸相关，这与以往的研究一致^[22]。 以往的研究表明在小鼠模型上，编码铁转运的 Ferroportin（Slc40a1）基因敲除可导致原肠胚发育 形成的内胚层缺陷，Ferroportin 基因突变的胚胎可 见发育迟缓、露脑畸形、小眼畸形和全身性水肿 等表型^[23]。Tao 等^[24] 对小鼠的研究表明，平面细 胞极性通路（PCP）核心基因- PRICKLE1 基因缺 失导致内胚层迁移和原条形成异常，从而引起内 胚层发育缺陷。Bassuk 等^[25] 发现纯合PRICKLE1 突变可以引起常染色体隐性渐进性肌阵挛癫痫， 共济失调综合征，而且这一突变也是通过导致原 肠胚发育缺陷而产生相应的表型。这些证据表明， 在胚胎发育的早期阶段，突变可引起胚层发育异 常而导致胚胎的发育缺陷。此外，Ferroportin 基因 和PRICKLE1 基因突变均导致内胚层发育缺陷也 给本研究提供了一个早期基因的异常能导致发育 中的三胚层发育异常的线索。

叶酸是一种重要的环境营养因素，其代谢对 维持正常胚胎发育非常重要，异常水平的叶酸可 增加发生NTD 的风险，而补充0.4~4.0 mg/d 的叶 酸能预防约50%~70% 的神经管畸形的发生^[10]。叶 酸作为一碳供体，参与核苷酸的合成和甲基转移反应，对DNA 和蛋白质的甲基化修饰非常重要。 所以本研究推测在发育的初期，叶酸代谢紊乱影 响了胚胎发育，进而导致三胚层发育异常，最后 产生胎儿的复杂畸形。研究表明，叶酸代谢相关 rs1801394 和rs1801133 SNP 是与包括NTD 在内的 复杂畸形风险相关的重要的生物标记，提示其可 能为NTD 等复杂畸形的病因之一^{[11, 13, 14, 17]}。在胚胎 发育过程中，MTRR 在胚胎植入前，卵母细胞发育 到囊胚过程中开始表达^[26]，并随后分布在神经管 和其他组织^[27]。小鼠中MTRR 基因敲除导致胚胎 死亡和出生缺陷^{[27, 28]}。这表明MTRR 正常水平对 胚胎发育至关重要，而MTRR rs1801394 突变致病 机理可能是由于SNP 位点位于MTRR 基因的功能 结构域，MTRR 突变影响MTRR 与蛋氨酸合成酶 MTR 的结合从而影响叶酸和一碳代谢^[29]。MTHFR 从卵母细胞发育开始表达，小鼠MTHFR 基因敲除 导致S- 腺苷甲硫氨酸表达水平显著降低，同时伴 有S- 腺苷高半胱氨酸水平显著增加。S- 腺苷高半 胱氨酸水平升高可引起广泛的DNA 甲基化水平降 低从而导致小脑发育畸形和脂质沉积^[30]。这与本 课题组以往报道的在中国山西人群中，神经管畸 形病例整体DNA 低甲基化水平是一致的^{[31, 32]}。这 些研究都提示MTRR 和MTHFR 在整个胚胎发生 过程中表达，并且它们的SNP 可能影响胚胎发育 的早期阶段，因此导致复杂畸形的表型。

本研究表明在我国出生缺陷高发山西人 群样本中，叶酸代谢相关基因多核苷酸多态性 rs1801394 和rs1801133 与多发出生缺陷风险相关， 并与胚层发育相关，本研究结果将有助于为出生 缺陷病因研究提供新的线索，为今后预防出生缺 陷提供实验证据。