全身炎症反应综合征（SIRS）是感染或非感 染病因作用于机体而引起机体失控的自我持续放 大和自我破坏的全身性炎症反应，其进行性加重 的最终结果是脓毒症^[1]；而在这一病理过程中众多 细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6 （IL-6）等在介导初次免疫应答和炎症反应中发挥 多重作用[2-3]。其中IL-6 是促炎过程中功能最为广 泛的炎性细胞因子之一，其血清浓度与脓毒症的 严重程度及预后有关 ^[4]；而TNFβ 作为前炎症因 子，在炎症性疾病的发生发展中具有重要意义。 研究IL-6 及TNFβ 多态性在我国人群中的分布特 征有助于了解全身性炎症反应的发病遗传背景， 为在分子水平研讨发病机制奠定基础。本研究以 广州汉族儿童为代表，抽样调查了IL-6（-174） 及TNFβNcoI 基因位点多态性在我国人群中的分 布状况，与不同国家、地区的人群分布特征进行 比较，为SIRS 的相关性研究提供资料。 1　资料与方法 1.1　研究对象

样本来自广州地区481 名学龄前健康儿童体 检血标本（其中300 份标本来自我院，181 例标本 来自广州市儿童医院），男性295 名，女性186 名。 年龄3~5.5 岁。 1.2　外周全血基因组DNA 的提取

抽取受试者空腹外周静脉血1.0 mL 加抗凝剂 EDTA 0.2~0.5 mL 混匀抗凝，按QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen,Hilden,Germany） 的操做指南进 行外周全血基因组DNA 提取；并将抽取的DNA 样本于-20℃冰箱保存。 1.3　IL-6（-174）等位基因测定

采用等位基因特异性聚合酶链式反应（ASPCR） 技术进行检测。（1） 合成IL-6-174 的 PCR 引物^[5]，G 特异性引物为5'-GCACTTTTC CCCCTAGTTGTGTCTTACG-3'；C 特异性引物 为5'-ATGACGACCTAAGC TTTACTTTTCCCCC TAGTTGTGTCTTGAC-3'； 共同下游引物为： 5'-ATAAATCTTTGTTGGAGG GTGAGG-3'（ 引物 均由上海生工生物技术有限责任公司合成） 。 （2）PCR 反应体系 Green Master Mix（2×） （Promega,Madison,USA）8.5 μL，G/C 特异性引 物及共同下游引物均为（0.8~1.0）μmol/L，模板 200~250 mg，最后加纯水补至25.0 μL； 按95 ℃ 预变性10 min ，然后94℃ 35 s，61℃ 45 s，72℃ 45 s，共30 个循环，72℃延伸5 min。（3）确定 基因型各取G、C 等位基因PCR 产物（10~15）μL 于20 g/L 琼脂糖凝胶（0.5 mg/ LEtBr）在EPS-300 电泳仪（稳压稳流电泳仪，上海天能科技有限公 司） 中电泳（80~90 V，30~45 min），以DL2000 DNAMarker 为分子量标准。将凝胶放置Gel Doc EQ 凝胶成像系统（Bio-RAD Gel Doc XR,USA）进行摄 像分析。根据电泳图上相应等位基因泳道是否出现 条带来判断结果：G/G 基因型在 G 等位基因泳道上 产生 121 bp 条带，而C/C 基因型在C 等位基因泳 道上产生一个136 bp 条带；G/C 基因型在G 及C 两等位基因泳道均产生121 bp 和136 bp 两种长度 的条带（图 1）。

图 1 IL-6（-174）G/C 位点AS-PCR 电泳图谱 M：DNA 分子质量标准；1、2 泳道代表为样本1；3、4 泳道代表 为样本2；5、6 泳道代表为样本3，3 样本均G 等位基因出现条带， 均为G/G 基因型。

采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态技 术（PCR-RFLP） 进行检测。（1） 扩增TNFβ 基因片段^[6]：上游引物5'-CCG TGC TrC GTG CTT TGG ACT A-3'，下游引物5'- AGA GCT GGT GGG GAC ATG TCT G-3'；PCR 反应体系：Green Master Mix（2×）（Promega,Madison,USA）25 μL，上下 游引物均为1.0 μmol/L，模板300~400 mg，最后 加纯水补至50.0 μL；按95℃预变性5 min ，然后 94℃ 30 s ，50℃ 60 s，72℃ 2 min，共37 个循环， 72 ℃延伸5 min。扩增产物片段长度为782 bp。 （2）酶切反应：酶切体系包括PCR 产物5 μL， 10x 酶切缓冲液2 μL，NcoI 0.5 U，加水至 20 μL，37℃恒温水浴2 h，65℃ 15~20 min 终止反 应。（3）确定基因型：取10~15 μL 酶切产物于20 g/L 琼脂糖凝胶（0.5 mg/ LEtBr）在EPS-300 电 泳仪（稳压稳流电泳仪，上海天能科技有限公司） 中电泳（80~90 V）1 h，以 DL 2000DNAMarker 为分子量标准。将凝胶放置Gel Doc EQ 凝胶成 像系统（Bio-RAD Gel Doc XR,USA） 进行摄像 分析。依据电泳图上产生的条带确定基因型： TNFβ1 纯合子可被完全酶切为586 bp、196 bp 2 条带；TNFβ1/TNFβ2 杂合子不完全酶切，出现 782 bp、586 bp、196 bp 3 条带；TNFβ2 纯合子不 产生酶切，只出现782 bp 1 条带（图 2）。

图 2 TNF-βNcoI 位点PCR-RFLP 电泳图谱 M： DNA 分子质量标准；1、2 为TNFβ1 纯合子；3、5 为 TNFβ2 纯合子；4、6、7、8、9 为TNFβ1/TNFβ2 杂合子。

为确保实验数据的准确，减少误差，基因型 的分型均由2 人判读，并随机抽取15% 重复，同 时随机抽取10% PCR 产物直接测序（上海英骏生 物技术有限公司），准确率均为100%。 1.6　统计学分析

数据应用Exce1 2000 软件进行统计分析，基 因型分布比较采用χ2 检验，P<0.05 为差异有统计 学意义。 2　结果 2.1　IL-6（-174）基因频率分析

481 例血标本等位基因检测仅发现Ｇ等位基 因，未测及Ｃ等位基因，基因型均为G/G；表明Ｃ 等位基因在广州汉族人群极罕见或不存在。对比 不同国家及我国不同地区正常人群IL-6（-174）位 点基因型及基因频率分布情况（表 1 及表 2）可看 出中国汉族人群IL-6（-174）位点基本为G/G 基因型，极少数G/C 基因型，罕见C/C 基因型或不存在， G 等位基因分布频率在97%~100% 间，C 等位基 因在0~3% 间。与韩国人群分布情况相似，而与英 国、德国、芬兰、巴西、伊朗人群的分布特征存 在明显差异，这些国家人群G、C 等位基因分布频 率均20% 以上，表明该位点多态性属常见变异， 在人群中普遍存在。

表 1(Table 1)

表 1 不同国家正常人群IL-6（-174）基因位点基因型及 基因频率分布比较

表 1 不同国家正常人群IL-6（-174）基因位点基因型及 基因频率分布比较

表 2(Table 2)

表 2 我国不同地区正常汉族人群IL-6（-174）位点基因 型及基因频率分布比较

表 2 我国不同地区正常汉族人群IL-6（-174）位点基因 型及基因频率分布比较

广州地区汉族儿童人群TNFβNcoI 位点有 TNFβ1*1、TNFβ1*2、TNFβ2*2 3 种基因型， 频率分别为24.7%、49.7% 和25.6%，TNFβ1 等 位基因频率为49.6%，TNFβ2 等位基因频率为 50.4%，其分布特征与韩国、日本相似（P>0.05）， 与美国、德国、意大利及土耳其人群差异有统计 学意义（P<0.05），见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 不同种族间正常人群TNFβNcoI 位点基因多态性比较　[例（％）]

表 3 不同种族间正常人群TNFβNcoI 位点基因多态性比较　[例（％）]

按Hard-Weinberg 定律作吻合度检验，各组平 衡吻合度之间差异无统计学意义（P>0.05）,表明 样本符合Hard-Weinberg 平衡，见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 Hard-Weinberg 平衡吻合度检验

表 4 Hard-Weinberg 平衡吻合度检验

随着人类基因组学研究的深入，已认识到 疾病是由环境因素（病原微生物等）和遗传因素 共同作用的多基因征侯群，个体遗传学机制的差 异性是个体差异的内在物质基础^[22]。促炎／抗炎 反应失控与炎症性疾病的发生发展密切相关，而 IL-6、TNFβ 是主要炎性细胞因子之一，对其进行 基因多态性研究，可为SIRS、脓毒症等易感人群 的早期识别、预后分析和免疫治疗提供新的理论 依据。

人类IL-6 基因的多态性主要为存在于启动子 区的-597G/A、-572C/G、-174G/C、-137AnTn^[23]。 理论上IL-6 启动区的任何多态性都有可能改变基 因的结合序列，影响个体对IL-6 基因相关性疾病 的易感性。鉴于-597G/A 与-174G/C 处于连锁不平 衡^[24]，故本研究仅观察了-174G/C 多态性的分布 与作用。国内蒋建新等^[25] 对我国10 个代表性民族 人群中的18 个脓毒症相关基因进行单核苷酸多态 性研究分析，结果显示，在我国人群中发生频率 >5% 的单核苷酸变异，与国外有88% 相符；发生 频率>10% 的变异，与国外有96% 相符。可见在 东西方人群大多数基因组多态性是相同的，尤其 是常见变异。IL-6（-174）多态性分布频率在国外 欧洲人群的发生率大于10%，属常见变异^[5]。但本研究仅测及广州地区汉族儿童人群IL-6（-174G） 基因及G/G 基因型，与国外人群的研究报道有明 显差异；对比国内不同地区的汉族人群IL-6（-174） 多态性研究结果，表明在我国汉族人群中该位点 多态性罕见或不存在，不宜选取该基因位点单核 苷酸多态性作SIRS 的关联性分析。

TNFβ 作为前炎性细胞因子，具有多种生物 活性；其第1 内含子内，转录起始位点下游第 252 位点（即第1 069 位点）处存在鸟嘌呤（G） → 腺嘌呤（A） 的单核苷酸多态性变化（+252 G/A）。该位点因能被NcoI 限制性内切酶识别切断， 也叫NcoI 位点，G 存在的基因称为TNFβ*1， A 存在的基因称为TNFβ*2。本研究此多态性在 广州汉族中分布相当广泛，有3 种基因型，即 TNFβ1*1、TNFβ1*2、TNFβ2*2，频率分别为 24.7%、49.7% 和25.6%。基因频率分布与白种人 及西亚人群有明显的差异，TNFβ*1 等位基因频 率（49.6%）远高于欧美白种人（13.3%~28.6%）， 低于西亚人群（76.0%），与东亚黄种人的分布特 征相似。国内研究报道表明TNFβ*2 等位基因与 我国汉族人群的系统性红斑狼疮（SLE）发病易感 性相关^[26]，这与韩国的相关研究结论一致，但与 德国对其国内SLE 患者的研究结果不同，其SLE 易感基因为TNFβ*1 等位基因^[27]。因此，在对一 些致病基因多态性进行研究时，首先了解其在人 群中的分布特点，是正确分析和阐述基因多态性 研究结果的关键。国内报道中TNFβ 与SIRS 的关 联性研究不多，而本研究对TNFβNcoI 位点多态 性在人群中的分布特性的研究结果为从基因水平 上研究TNFβ 基因多态性与SIRS 的关系奠定了基 础。

本研究经过对广州地区健康汉族儿童群体进 行IL-6（-174） 及TNFβNcoI 位点多态性分析， 结果表明：IL-6（-174）位点多态性在汉族人群中 罕见或不存在，不应选取该基因位点单核苷酸多 态性作SIRS 的关联性分析；TNFβNcoI 位点多态 性在汉族中普遍存在，分布特征与白种人存在差 异。样本为Hardy-Weinberg 平衡群体，可进一步 用于广州地区汉族儿童的SIRS 关联性分析。