解偶联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）是 存在于线粒体内膜的质子转运体，广泛表达于各 种器官组织中，包括脾、肺、肠、脑、心肌、胰 岛细胞和白色脂肪组织^[1]。UCP2 在限制线粒体活 性氧（reactive oxygen species,ROS）产生和能量生 成调控方面具有关键作用。UCP2 可参与各种病理 生理过程，包括胰岛素的分泌、肥胖、糖尿病或 神经细胞的活动及缺血再灌注损伤等^[2]。最新研究 发现UCP2 可以通过介导ROS 的产生参与细胞内 炎症反应的调控^[3]。炎症损伤是脓毒症心肌损伤 的重要病理生理机制，目前对于UCP2 在脓毒症心 肌病的具体作用机制国内还尚未有报道，为了探 索UCP2 参与脓毒症心肌病的可能发病机制，本研 究拟运用脓毒症大鼠血清诱导刺激大鼠心肌细胞 株H9C2 细胞建立脓毒症心肌损伤体外模型，通过 RNA 干扰技术影响UCP2 基因的表达，探讨UCP2 对脓毒症心肌损伤MAPK、NF-κB 炎症通路以及炎 症因子TNF-α、IL-1β 的影响。 1　材料与方法 1.1　动物与材料

健康成年清洁级（SPF）雄性Sprague-Dawley 大鼠30 只（广东省医学实验动物中心提供）， 体重250~300 g； 大肠埃希菌脂多糖（LPS， Escherichiacoli0111：134，美国Sigma 公司）； UCP2 多克隆羊抗体，β-actin 抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc ）；磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK） 和核转录因子（NF-κB）抗体（购于Cell Signaling Technology,Inc.）；Trizol，PrimeScript™ RT reagent Kit，SYBR® Premix Ex Taq™（ 大连宝生生物公 司）；ABI 7500 荧光定量PCR 仪、ABI9700PCR 仪（美国应用生物公司）；阳离子脂质体hilymax （同仁化学公司）。根据GenBank 的UCP2 基因 序列（NM_019354.2），由广州锐博公司设计并 合成 3 对siRNA 并设计阴性对照siRNA。UCP2- siRNA1 上游GCACUGUCGAAGCCUACAAdTdT， 下游dTdTCGUGACAGCUUCGGAUGUU；UCP2- siRNA2 上游CCUCAUGACAGACGACCUCdTdT， 下游dTdT GGAGUACUGUCUGCUGGAG；UCP2- siRNA3 上游CCUGGAACGUAGUAAUGUUdTdT， 下游d T d T G G A C C U U G C A U C A U U A C A A 。 UCP2、β-actin、TNF-α、IL-1β 引物由上 海英伟捷基公司设计并合成。UCP2 引物序 列： 上游ACCATTGCACGAGAGGAAGG，下 游TCTTGACCACATCAACGGGG；β-actin 引 物序列： 上游GCAGGAGTACGATGAGTCCG， 下游ACGCAGCTCAGTAACAGT；TNF-α 引物 序列： 上游AACACACGAGACGCTGAAGT，下 游TCCAGTGAGTTCCGAAAGCC；IL-1β 引物序 列： 上游CCTTGTCGAGAATGGGCAGT，下游 TTCTGTCGACAATGCTGCCT。 1.2　脓毒症大鼠和正常大鼠血清制备

实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。脓毒症大 鼠血清制备参照文献方法^[4]，内素素 （大肠埃希 菌脂多糖，LPS）10 mg/kg 腹腔注射，6 h 后无菌 心脏穿刺采血，4℃静置30 min，800 r/min 离心后 生物安全柜内收集上清液。-80℃保存待用。正常 大鼠血清取自不经任何干预大鼠，方法同上。 1.3　细胞培养转染

H9C2 细胞由南方医科大学珠江医院心内科保 存，转染前1 d 将大约4×10⁵ 个细胞接种于6 孔 板中，当细胞覆盖达60%~80％时采用阳离子脂 质体分别转染siRNA。转染方法参照hilymax 说明 书，转染后37℃培养箱培养，4~6 h 后换含血清培 养液继续培养，先从由锐博公司合成的siRNA1、 siRNA2、siRNA3 序列筛选出有效干扰序列，转染 后进行后续实验。 1.4　细胞分组及处理

体外培养大鼠心肌细胞株（H9C2）随机分为 5 组：空白对照组、正常血清组、10％脓毒症血清 刺激12 h 组（脓毒症血清组）、UCP2-siRNA 干扰 +10％脓毒症血清刺激12 h 组（UCP2-siRNA+ 脓 毒症血清组）、阴性siRNA 转染+10％脓毒症血 清刺激12 h 组（阴性siRNA + 脓毒症血清组）， 每组设3 个复孔。（1）空白对照组不经处理，大 鼠H9C2 心肌细胞株在含10% 胎牛血清DEME- 高 糖培养基下培养箱培养；（2）正常血清处理组： 待当细胞生长至70%~80% 密度时，加入10% 正 常大鼠血清培养12 h；（3）10％脓毒症血清刺激 12 h 组：待当细胞生长至70%~80% 密度时加入 10% 脓毒症大鼠血清培养12 h；（4）阴性siRNA 转染+10％脓毒症血清刺激12 h 组：待细胞生长 至70%~80% 密度时先行阴性si-RNA 转染，转染24 h 后加入10% 脓毒症大鼠血清培养12 h； （5）UCP2-siRNA 干扰+10％脓毒症血清刺激12 h 组：待细胞生长至70%~80% 密度时先行UCP2si- RNA 转染，转染24 h 后加入10% 脓毒症大鼠血清 培养12 h。 1.5　RT-PCR 检测UCP2、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达

采用TRizol 试剂提取H9C2 心肌细胞总 RNA，ND-100 分光光度计测得RNA 的纯度和含 量。取500 ng RNA 进行逆转录反应合成cDNA。 然后以20 μL 反应体系SyberGreen 荧光定量PCR 检测。PCR 热循环参数： 95℃预变性30 s，95℃ 变性5 s，60℃退火34 s，40 个循环。用ΔΔCt 法 计算mRNA 的变化。 1.6　Western blot 检测UCP2、p-p38MAPK、NF-κB 蛋白表达

采用全蛋白提取试剂盒提取H9C2 心肌细胞 总蛋白，BCA 法测蛋白浓度。用凝胶加样缓冲液 将各管蛋白样品煮沸5 min。按每孔20 μg 蛋白量 加样SDS-PAGE 电泳，电泳结束后将凝胶取出， 根据Marker 切胶、转膜，丽春红预染。5％脱脂 奶粉的TBST 封闭室温2 h，TBST 漂洗3 次，每 次10 min，羊抗UCP2（1 : 500）、兔抗beta-actin （1 : 1 000）、兔抗磷酸化p38MAPK（1 : 1 000）和 核转录因子NF-κB（1 : 1 000）抗体孵育，4℃摇床 过夜，TBST 洗3 次，每次10 min，（1 : 7 500）二 抗室温孵育1 h，TBST 洗3 次，每次10 min 后使 用ECL 发光法暗室显影，扫描分析。以β-actin 作为内参照，分析UCP2、p-p38MAPK、NF-κB 条 带灰度变化。 1.7　统计学分析

应用SPSS 18.0 软件对数据进行分析，数据 以均数± 标准差（x±s）表示，多组样本之间 比较采取方差分析，方差不齐时用Welch 校正检 验。多个样本均数间的多重比较采用LSD 法或 Dunnetts T3 法检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　Western blot 和RT-PCR 筛选最有效的siRNA

siRNA1、siRNA2、siRNA3 等3 对干扰序列进 行干扰，3 对序列均可以明显沉默UCP2 mRNA 表 达（P<0.01），其中siRNA2 序列对UCP2 mRNA 抑制效果最强，即siRNA2 干扰H9C2 心肌细胞后， 干扰效果最强。荧光定量PCR 结果显示siRNA 2 组序列UCP2 相对表达为（0.286±0.010），明显 低于对照组（1.038±0.044），差异有统计学意义 （F=97.86，P<0.01）。同时蛋白水平显示siRNA 2 序列最有效，故后续实验均以siRNA 2 为靶序列 进行。见图 1，2。

图 1 荧光定量PCR 检测各组细胞UCP2 mRNA 沉 默效率（n=3） 注：a 示与对照组相比，P<0.01；b 示与阴性 siRNA 组比较，P<0.01；c 示与siRNA1 组比较，P<0.01；d 示与 siRNA2 组比较，P<0.01。

图 2 UCP2 siRNA2 序列干扰效果Western blot 验证图

脓毒症血清刺激H9C2 心肌细胞株后细胞 p-p38、NF-κB 蛋白表达与对照组和正常血清组 相比均明显增加（P<0.05），其中UCP2-siRNA+ 脓毒症血清组表达较脓毒症大鼠血清组更加显著 （P<0.05），见表 1，图 3。

表 1(Table 1)

表 1 各组细胞p-p38 和NF-κB 蛋白表达的变化

表 1 各组细胞p-p38 和NF-κB 蛋白表达的变化

图 3 各组细胞p-p38 和NF-κB 蛋白表达　1：空白 对照组；2：正常大鼠血清组；3：脓毒症血清组；4：阴性siRNA 转染+ 脓毒症血清组；5：UCP2-siRNA 干扰+ 脓毒症血清组。

荧光定量PCR 检测显示，脓毒症大鼠血清刺 激后各组细胞TNF-α、IL-1βmRNA 表达均明显上 调。与正常对照、正常血清组相比，脓毒症血清 组、阴性siRNA+ 脓毒症血清组、UCP2-siRNA+ 脓 毒症血清组TNF-α mRNA 相对表达（2.74±0.29， 2.81±0.39，4.72±0.27）均明显增高，差异均有统 计学意义（P<0.01）,其中UCP2-siRNA+ 脓毒症血 清组与脓毒症血清组和阴性siRNA+ 脓毒症血清组 比较有明显增高，差异统计学意义（P<0.01）。脓 毒症血清组、阴性siRNA+ 脓毒症血清组、UCP2- siRNA+ 脓毒症血清组IL-1βmRNA 相对表达分别 为（11.8±1.6，12.8±2.6，13.2±0.5） 均明显高 于正常对照组和正常血清组（P<0.01），脓毒症血 清组、阴性siRNA+ 脓毒症血清组与UCP2-siRNA+ 脓毒症血清组之间相比差异均无统计学意义。见 图 4。

图 4 荧光定量PCR 各组TNF-a、IL-1βmRNA 的 表达（x±s，n=3）　A：正常对照组；B：正常大鼠血清组；C： 脓毒症血清组；D：阴性siRNA + 脓毒症血清组；E：UCP2-siRNA + 脓毒症血清组。注：a 示与对照组相比，P<0.01，b 示与正常血 清组比较，P<0.01。c 示与脓毒症血清组比较，P<0.01；d 示与阴 性siRNA + 脓毒症血清组比较，P<0.01。

脓毒症心肌病是脓毒症的严重并发症之一， 其主要表现包括有可逆性的双心室扩张、心肌射 血分数下降，对液体复苏和正性肌力药物的反应 下降，同时出现血液中肌钙蛋白、BNP 酶学等心 肌标记物上升^[5]。目前关于脓毒症心肌病的病理生 理机制仍不明确，有研究认为一氧化氮、线粒体 功能障碍、循环补体和细胞因子在其中发挥关键 作用^[6]。当细菌所致脓毒症时，G^- 菌的LPS 或G⁺ 菌的肽聚糖和磷壁酸通过与模式识别受体（PRRs） 识别，进而激活单核- 巨噬细胞系统NF-κB 和丝 裂原激活的蛋白激酶MAPK 等炎症通路，随之大 量炎症介质和细胞因子释放（如IL-6、TNF-α、 IL-1 等）[7-9]。血液循环中的内毒素、炎症介质和 细胞因子，一方面可以直接对心肌细胞造成损害， 另外可以激活心肌细胞内MAPK，NF-KB 等炎症 通路，影响心肌功能^[10]。既往研究结果显示， p38MAPK，NF-KB 信号转导通路在脓毒症心肌组 织中激活，并促发TNF-α 和IL-1β 等炎症介质的 释放，阻断两者信号转导通路可改善心肌损伤^[11]。 本研究也发现，在脓毒症大鼠血清刺激作用下， H9C2 心肌细胞株内p-p38MAPK 和NF-κB 表达发 生上调； TNF-α mRNA、IL-1βmRNA 也发生上调。

研究证实UCP2 可以调控细胞内炎症反应， UCP2 基因敲除小鼠在LPS 作用下其血清TNF 和 干扰素α 的水平较野生型小鼠更高，同时巨噬细 胞的NF-κB 表达也更高，这可能与UCP2 通过影 响细胞内ROS 的产生起作用的^[12]。最近Chul 等^[13] 研究发现，能够有效下调细胞内炎症反应的一个 细胞内信号分子细胞核孤儿受体—微小异源二聚 体伴侣基因（small heterodimer partner,SHP） 是 通过UCP2 影响细胞内氧化应激信号起作用的。 UCP2 基因对于脓毒症心肌病作用的研究还未见 报道。在脓毒症血清诱导刺激下大鼠心肌细胞株 细胞内炎症通路被激活，并且炎症因子TNF-α、 IL-1β 在mRNA 水平上表达上调。进一步研究发 现RNA 干扰技术沉默H9C2 细胞UCP2 基因后， 细胞内p38MAPK 活性和NF-κB 激活加强，TNF-α 转录增强。提示UCP2siRNA 转染可以促进心肌细 胞内炎症反应，因此推测，UCP2 在脓毒症心肌组 织表达可能能够反馈下调心肌细胞内炎症通路和 氧化应激损伤。但是本研究未能验证UCP2 如何影 响炎症通路的形成。在细胞模型方面，本研究只 选用单一的基因干扰，严格来说需同时使用过表 达技术双方面验证甚至需要使用基因敲除或转基 因动物进一步验证。所以就UCP2 在脓毒症心肌病 的具体机制还有待进一步研究。