随着现代诊疗技术的进步，极低和超低出生 体重早产儿存活率明显提高，与之相关的并发症 如支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）的发生率也愈来愈高。长时间高浓度供氧是 导致早产儿 BPD 发生的重要原因，因此，高氧暴 露细胞和动物模型成为了研究 BPD 发病机制的经 典模型^{[1, 2, 3, 4]}。肺泡化受阻和肺泡微血管发育障碍是 BPD 的主要病理特征，肺组织多种细胞的异常增殖、分化和凋亡参与了此病理过程的发生和发展^[2]。 与肺泡上皮细胞以及血管内皮细胞一样，肺成纤 维细胞（lung fibroblasts,LFs）也是高氧暴露肺组 织损伤后参与应答反应的主要效应细胞之一^[1]。 高氧时，需要间质 LFs 产生多种生物活性物质， 促进Ⅱ型肺泡上皮细胞（type Ⅱ alveolar epithelial cell,AEC Ⅱ）增殖、移行并分化为Ⅰ型肺泡上皮 细胞（type Ⅰ alveolar epithelial cell,AEC Ⅰ）以修 复受损的肺泡结构^{[1, 2, 4]}。p53 基因在调节细胞周期 和细胞增殖过程中发挥重要作用，高氧可通过依 赖 p53 和非依赖 p53 的途径促进 AEC Ⅱ凋亡、抑 制 LFs 增殖并影响其生物学功能，从而导致肺泡 发育受阻^{[2, 3, 4]}。本实验在前期研究基础上，通过观 察延长高氧暴露时间后胎鼠 LFs p53 及增殖细胞核 抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表 达变化，进一步探讨高氧改变 LFs 增殖及生存状 况的可能机制，为 BPD 的防治提供理论依据。 1　材料与方法 1.1　胎鼠 LFs 原代培养

参照李文斌等^[5] 方法进行：无菌条件下取孕 19 d Sprague-Dawley（SD）大鼠胎鼠肺组织，剪 碎，D-Hanks 液漂洗，0.1% 胰蛋白酶（含 0.02% Dnase，按每肺 0.5 mL）室温下消化 15 min，用 等量含 10% 胎牛血清（FCS，浙江三利生物制品 有限公司）的 MEM（GIBCO 公司）终止消化， 过 100 目、200 目 筛 网 各 1 次，4 ℃ 1 500 rpm 离 心 5 min，弃上清，沉淀重悬，调整细胞浓度接种 于 96 孔板或 50 mL 玻璃培养瓶（部分培养瓶中放 有细胞爬片），置 5% CO₂培养箱 37℃培养 40 min 至 1 h，换液，贴壁细胞即为原代胎鼠 LFs。 1.2　细胞鉴定及 LFs 纯度计算

Vimentin 是 LFs 胞浆中特征性蛋白。细胞爬 片经 4℃ 丙酮固定 10 min，晾干，粘片。采用免疫 细胞化学 SP 法鉴定（SP Kit 和 DAB Kit，北京中 山生物技术有限公司），操作步骤严格按试剂盒 说明书进行。小鼠抗大鼠 Vimentin（Santa Cruz 公 司）工作液浓度为 1 : 100。在显微镜下（×60 倍） 随机选取同一细胞爬片 3 个视野，计算 Vimentin 阳性细胞占整个视野的百分率，即为 LFs 纯度。 1.3　实验分组

经鉴定后，待 LFs 生长至亚汇合状态时，将 培养瓶中培养液换成含 2% FCS 的 MEM，并随机 分为空气组（n=6）和高氧组（n=6）。空气组置 于 5% CO₂培养箱中；高氧组通 95% O₂ / 5% CO₂高 纯混合气（2 L/min）10 min 后密封，置培养箱中 培养 12 h 和 24 h。其中高氧组在培养结束时均用 测氧仪检测培养瓶中氧浓度，氧浓度低于 90% 的 样本弃去。 1.4　噻唑蓝（MTT）实验检测 LFs 细胞抑制率

待 96 孔板中原代胎鼠 LFs 生长至铺满板底 约 70% 时，分设空白对照组、空气对照组和 90% 高氧组，每组设 6 复孔，分别培养 12 h 和 24 h， 弃去培养液，每孔加入 5 g/L MTT（华美公司） 10 μL，继续孵育4 h，每孔加入100 μL 二甲亚 砜（DMSO） 终 止，振 荡 15 min，450 型 ELISAReader 酶标仪（Bio-Red 公司）570 nm 波长检测吸 光度。以空气对照组细胞活力为 100%，按公式： 细胞抑制率 =1-（高氧组吸光度 - 空白对照组吸光 度）/（空气对照组吸光度 - 空白对照组吸光度） ×100%，计算高氧状态下细胞生长抑制率。 1.5　RT-PCR 检测 p53 mRNA 表达

按Trizol试剂（上海华舜生物工程有限公 司）一步法提取细胞RNA。经紫外分光光度 法定量后，取2 μg RNA 用 M-MLV逆转录酶 （Promega 公司）进行逆转录反应合成 cDNA。 以β-actin 为内参照，分别取 1 μL 模板进行 PCR 反应，相应引物（均由北京赛百盛基因技术有 限公司合成）序列分别为：β-actin（280 bp）： 上 游 5'-AACGCAGCTCAGTAACAGTC-3'，下 游 5'-ATCCGTAAAAGCCTCTATGC-3'；p53（551 bp）： 上游 5'-CTACAAGCAGTCACAGCACATGAC-3'，下 游 5'-TCATTCAGCTCTCGGAACATCTCG-3'。 反 应 条件为预变性 94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s， 72℃ 1 min，30 个循环后 72℃延伸 10 min。产物 经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍 照，每组实验至少重复 3 次，条带用 GDS-8000 型 凝胶成像分析系统进行分析，比较 p53 与 β-actin 扩增条带灰度比值（A p53/A β-actin）。实验重复 3 次。 1.6　Western blot 检测 p53 和 PCNA 蛋白表达

裂解细胞提取蛋白，按每泳道加总蛋白 50 μg进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，半干式电转移至硝酸 纤维素滤膜上，室温封闭 2 h 后，加入相应的小鼠 抗β-actin 单克隆抗体（1 : 500，Neomarks）、兔 抗大鼠 p53 多克隆抗体（1 : 500，abcam）或小鼠 抗大鼠 PCNA 单克隆抗体（1 : 300，Santa Cruz）， 4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶 标记的二抗（1 : 2 000），ECL 增强化学发光显色 系统显色。每组实验至少重复 3 次，用 GDS-8000 型凝胶成像分析系统进行扫描，以 p53 或 PCNA 与β-actin 条带面积灰度比值进行比较和半定量分 析。实验重复 3 次。 1.7　统计学分析

采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析，数据以均 数 ± 标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析、 t检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。 2　结果 2.1　细胞鉴定

经鉴定，细胞爬片上 LFs 纯度为（95±1）% （n=6）表明所获细胞适合研究使用（图 1）。

图 1　胎鼠 LFs 细胞浆中 Vimentin 表达 （SP 法，×60）

充氧前倒置相差显微镜下观察，绝大多数细 胞胞体明亮，紧贴瓶底，无悬浮细胞，呈良好生 长状态。随时间延长，高氧组镜下观察可见细胞 胞体折光率降低，细胞生长状态欠佳，悬浮细胞 增多，但大多数细胞仍具有活力。空气组细胞则 无明显改变。MTT 结果显示，高氧 12 h 和 24 h 时， LFs 生长抑制率分别为 8% 和 23%。 2.3　高氧对胎鼠 LFs p53 mRNA 表达的影响

与同时间空气组比较，高氧12 h时，p53 mRNA 表达即显著升高（1.57±0.13 vs 0.85±0.08， t=8.1763，P<0.01）；高氧 24 h 时其表达升高更 为 显 著（5.16±0.13 vs 2.52±0.16，t=21.3975， P<0.01）。在空气组，24 h p53 mRNA 表达明显 高 于 12 h（2.52±0.16 vs 0.85±0.08，t=15.8859， P<0.01）。在高氧组，24 h p53 mRNA 表达也明显 高 于 12 h（5.16±0.13 vs 1.57±0.13，t=33.1861， P<0.01）（图 2、3）。

图 2　各组胎鼠 LFs p53 mRNA 表达（n=6）　　 注：1. 空气12 h；2. 高氧12 h；3. 空气24 h；4.高氧24 h；5.DNA Marker。

图 3　各组胎鼠 LFs p53 mRNA 表达（n=6） 注：a 示与同时间空气组比较， P<0.01；b 示与同组 12 h 比较，P<0.01。

与同时间空气组比较，高氧组12 h 和24 h 时 的 p53 蛋 白 表 达 显 著 升 高（ 分 别 0.86±0.05 vs 0.54±0.06，t=7.494，P<0.01；0.98±0.05 vs 0.25±0.02，t=23.8476，P<0.01）。 在 空 气 组， 12 h p53 蛋 白 表 达 明 显 高 于 24 h（0.54±0.06 vs 0.25±0.02，t=8.5369，P<0.01）； 在 高 氧 组， 12 h p53 蛋 白 表 达 明 显 低 于 24 h（0.86±0.05 vs 0.98±0.05，t=3.0630，P<0.05）。见图 4、5。

图 4　各组胎鼠 LFs p53 和 PCNA 蛋白表达（n=6）　 注：1. 空气 12 h；2. 高氧 12 h；3. 空气 24 h；4. 高氧 24 h。

图 5 各组胎鼠 LFs p53 表达（n=6） 注：a 示与同时间空气组比较，P<0.01；b 示与同组 12 h 比较，P<0.01。

12 h时2组PCNA蛋白表达无明显差异 （0.86±0.07 vs 0.79±0.04，t=1.5284，P>0.05）； 但高氧组24 h时PCNA蛋白表达明显低于空 气 组（0.20±0.01 vs 0.53±0.05，t=10.3727， P<0.01）。 2 组 24 h PCNA 表达均明显低于 12 h （ 空 气 组：0.53±0.05 vs 0.86±0.07，t=6.7878， P<0.01； 高 氧 组：0.20±0.01 vs 0.79±0.04， t=27.1402，P<0.01）（图 4、6）。

图 6　各组胎鼠 PCNA 蛋白表达的影响（n=6） 注：a 示与同时间空气组比较，P<0.01；b 示与同组 12 h 比较， P<0.01。

氧疗是治疗新生儿疾病的常用手段，但长时 间高氧暴露可导致大量活性氧（ROS）的产生，由 于新生儿尤其是早产儿自身抗氧化防御能力不足， 这些具有高度活性的 ROS 可广泛地攻击靶细胞结 构成分，导致 DNA 等大分子物质破坏，是造成早 产儿 BPD 发生的重要分子机制^{[2, 6, 7]} 。同时，DNA 分子损害可启动细胞内一系列信号转导级联反应， 抑制细胞增殖，并诱导细胞发生坏死、凋亡。

PCNA 是 DNA 聚合酶δ的一种辅助蛋白，作 为 S 期细胞的一个标志物，用于检测细胞的增殖 能力，是判定细胞增殖状态的有效指标之一，并 与高氧肺损伤时细胞增殖状况有很好相关性^[1,8]。 本课题组前期研究显示，高氧暴露 12 h 可导致胎 鼠 AECII 大量坏死、凋亡，其 PCNA 蛋白表达下降， 增殖受到抑制；但 LFs 所受影响较小，且其 PCNA 蛋白表达水平也没有明显变化，2 种细胞对高氧暴 露的差异性表现可能是导致未成熟肺组织异常重 构的重要原因^[9]。本研究进一步延长高氧暴露至 24 h，发现胎鼠 LFs PCNA 蛋白表达水平亦开始明 显降低，提示高氧暴露持续时间延长也可进一步 抑制 LFs 的增殖。这种高氧所致细胞增殖抑制可 导致肺间隔形成受阻和肺泡化程度降低^[9]。

肿瘤抑制基因 p53 的表达产物 p53 是细胞周 期的重要检测点蛋白（checkpoint protein）。多种 形式的氧应激可激活 p53，使其磷酸化，后者作为 转录因子可调控多种基因的表达，并介导细胞周 期抑制，促进 DNA 修复或诱导细胞凋亡^{[6, 7]}。本 研究结果显示，95% 高氧暴露 12 h 和 24 h 时胎鼠 LFs p53 mRNA 及其蛋白表达水平均明显增高，提 示 p53 参与了高氧暴露后 LFs 的细胞周期调控。 p53 调控的一个主要靶基因是细胞周期依赖性激 酶抑制蛋白 p21，后者是 G1/S 期检测点蛋白。p21 氨基端可与 G1/S 期细胞周期蛋白及其依赖性蛋白 激酶复合物（cyclins-CDK）结合使细胞周期阻滞 于 G1/S 期，羧基端可与 PCNA 结合抑制 DNA 复 制，促进修复，一旦修复不成功，则诱导细胞发 生凋亡^{[3, 10, 11, 12]}。本研究结果提示，95% 高氧暴露 后，尤其是 24 h 时，LFs 生长抑制率达 23%，同 时 PCNA 的表达明显降低、p53 表达升高，表明高 氧暴露抑制 LFs 增殖同时，也抑制了其 DNA 复制。动物研究表明，80% 高氧暴露可通过降低组蛋白 去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）的表达及 活化促进 p21 的转录，从而抑制细胞增殖，并进 一步导致新生小鼠肺组织发育障碍，但并没有发 生肺细胞凋亡 ^[2]。也就是说，p21 的表达也可通过 非依赖 p53（如 HDAC）的途径调控肺细胞的增殖 和凋亡，从而对高氧肺损伤的结局产生影响。那么， 高氧暴露下，LFs 是否通过 HDAC 信号途径在抑制 其增殖同时，避免了凋亡发生？ p53 与 HDAC 信 号通路之间是否存在联系？目前尚不清楚。

综上，随高氧暴露时间延长，不仅 AECII 发 生增殖抑制，LFs 的增殖也受到影响，但 LFs 并不 象 AECII 一样发生坏死或凋亡，其具体机制尚有 待进一步研究。