新生儿重度缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）为新生儿死亡及儿童致残的 重要原因之一，目前仍无有效的根治性治疗措施。 近 10 年来干细胞移植研究有了重大突破。其中， 人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）是最新研究的 热点之一。研究表明 MSCs 对大鼠缺氧缺血性脑 损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）有保 护作用，但其确切机制尚不清楚^{[1, 2]}。HIE 发病机 制复杂，其中，脑缺氧缺血所诱导的细胞凋亡是 HIE 病理改变及神经系统后遗症的重要原因 ^[3]，而 PI3K/Akt 为经典的抗凋亡促存活信号通路 ^[4]：神经 营养因子激活酪氨酸激酶受体，通过一系列级联 反应，最终抑制凋亡关键酶 Caspase-3 活化，从而 阻断细胞凋亡。因此设想 hUC-MSCs 移植治疗新生 大鼠 HIBD 可能主要通过释放神经营养因子，抑制 Caspase-3 活化进而减少细胞凋亡，发挥神经保护 作用。本研究拟探讨 hUC-MSCs 通过 Caspase-3对 细胞凋亡的抑制调控、hUC-MSCs 自分化及对内源 性神经样细胞的促分化作用，从而揭示 hUC-MSCs 移植治疗新生大鼠 HIBD 的关键性机制。 1　材料与方法 1.1　材料

hUC-MSCs 购自四川省干细胞库。其他材料 包括5-溴脱氧嘧啶尿苷（BrdU，中杉金桥）， TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒（Roche），小 鼠抗人 BrdU 抗体（1 : 250，abcam），兔抗大鼠 GFAP 抗体（1 : 1 000，abcam），兔抗大鼠 NSE 抗 体（1 : 200，abcam），山羊抗兔 IgG/FITC（1 : 100， 中 杉 金 桥），山 羊 抗 小 鼠 IgG/TRITC（1 : 100， 中杉金桥），兔抗大鼠 Caspase-3 抗体（1 : 500， beyotime），小鼠抗大鼠 β-actin 抗体（1 : 3 000， 中杉金桥），山羊抗兔 IgG/ 辣根酶标记（1 : 3 000， 中杉金桥），山羊抗小鼠 IgG/ 辣根酶标记（1 : 3 000， 中杉金桥），DMI4000B 倒置荧光显微镜，CM1900 冰冻切片机，ULTRA · LUMTM 凝胶成像系统等。 1.2　实验动物及分组

健 康 清 洁 级 新 生 10 日 龄 Sprague-Dawley （SD）大鼠182 只，雌雄不限，平均出生体重 16.6±2.8 g，购自于成都达硕实验动物有限公司。 将 SD 大鼠随机分为假手术组（56 只）、移植组 （MSCs，56 只）及 HIBD 组（56 只）。缺氧缺血 后，MSCs 组动物死亡 6 只，HIBD 组动物死亡 8 只， 随机补充大鼠 14 只，保证每组动物均为 56 只。 将每组按5 个时间点分为5 个亚组，即移植后 24、48 h 及 1、2、3 周，其中，前 2 个时间点亚 组动物数目为 16 只（8 只用于 TUNEL 检测，8 只 用于 Western blot 检测），后 3 个时间点亚组动物 数目为 8 只（均用于免疫荧光检测）。采用 Rice 法^[5] 制作 HIBD 模型：乙醚麻醉后常规消毒铺巾， 颈部正中偏右作长约 0.5 cm 切口，分离并结扎右 侧颈总动脉后缝合皮肤；1 h 后置于 92% N₂ 和 8% O₂的缺氧舱中 2.5 h，流量 2 L/min。假手术组大鼠 仅游离右侧颈总动脉，不作结扎及缺氧处理。 1.3　BrdU 标记 hUC-MSCs

细胞传代后，将 BrdU 以 200 μmol/L 加入培养 液中。48 h 后，免疫荧光检测 BrdU 标记是否成功。 将 BrdU 标记的 hUC-MSCs 用生理盐水制成浓度为 4×10⁴/μL 的单细胞混悬液备用。 1.4　侧脑室移植方法

MSCs 组在 HIBD 建模后 24 h，取 hUC-MSCs 悬液 5 μL 注入动物右侧脑室内，注射部位为人字 缝前 3.0 mm，右 1.8 mm，进针深度 2.3 mm。注射 时间 5 min，注射后留针 5 min。HIBD 组及假手术 组动物于同时间，以同部位、同方式注入等量生 理盐水。 1.5　TUNEL 检测移植后细胞的凋亡情况

于侧脑室移植 24、48 h，将各组动物麻醉后 断头取脑，包埋并置于 -80℃冻存 2 h 以上，连续 冠状切片后行 TUNEL 染色，观察凋亡情况。 1.6　Western blot 检测移植后 Caspase-3 的表达

于侧脑室移植 24、48 h 后，将动物麻醉后断 头取脑，Western blot 检测 Caspase-3 的表达。凝胶 成像分析软件测定 Western blot 所得条带的积分光 密度值（IOD）。 1.7　神经行为学评价

于侧脑室移植后 1、2、3 周，运用 Longa 评 分法^[6] 对各组大鼠进行神经行为学评价。其分值 越高，表明其神经功能异常程度越重。 1.8　免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白、神经元特 异烯醇化酶

于侧脑室移植后1、2、3 周，将各组动物麻醉后断头取脑，包埋并置于 -80℃冻存 2 h 以 上，连续冠状切片后行 BrdU 及胶质纤维酸性蛋白 （GFAP）或神经元特异烯醇化酶（NSE）双标染色， 荧光显微镜下观察移植细胞的存活、迁徙、分化 情况。每只动物随机选取 10 个视野运用 Image-Pro plus 软件计算 GFAP、NSE 的免疫荧光强度。 1.9　统计学分析

运用 SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，各 组数据以均数 ± 标准差（x±s）表示，组间比较 采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　BrdU 标记 hUC-MSCs 的鉴定

BrdU 标记 hUC-MSCs，荧光显微镜下可见红 色荧光（图 1A），而对照组为阴性（图 1B）。

图 1　免疫荧光鉴定 Brd U 标记的 hUC-MSCs（×200） 　　 A：Brd U 标记的 hUC-MSCs 可见红色荧光；B：阴性对照。

移植后 48 h 进行凋亡检测，每组随机选取 10 个视野，细胞核呈绿色的为 TUNEL 阳性细胞，计 算阳性细胞百分率作为凋亡指数。其中，假手术 组细胞凋亡数较少，HIBD 组的凋亡数最为明显， MSCs 组较 HIBD 组明显减少。见表 1。

表1(Table 1)

表 1　移植后 3 组大鼠细胞凋亡指数比较　（x±s，％）

表1 移植后 3 组大鼠细胞凋亡指数比较　（x±s，％）

移植后 24、48 h，HIBD 组的表达量最为明 显，MSCs 组较 HIBD 组减少，而较假手术组增高 （P<0.05）（图 2）。

图 2 Caspase-3的表达（n=8）　　 图 A、B 分 别 为 Western blot 检测和定量分析 Caspase-3 的表达。a 示与假手术组比 较，P<0.05；b 示与 HIBD 组比较，P<0.05（Sham：假手术组； MSCs：MSCs 组；HIBD：HIBD 组）。

移植后，随日龄增加，MSCs 组新生大鼠在精 神状态、反应能力、运动功能等各方面较 HIBD 组 逐渐改善。移植后 2、3 周，MSCs 组 Longa 评分较 HIBD 组明显降低（P<0.05），见表 2。

表2(Table 2)

表 2　3 组大鼠不同时间点 Longa 评分比较（x±s，％）

表2 3 组大鼠不同时间点 Longa 评分比较（x±s，％）

MSCs 组在移植后 1、2、3 周，免疫荧光可见 BrdU 阳性细胞表达，主要分布于损伤侧海马区域 及大脑皮质，部分 hUC-MSCs 胞浆内 GFAP 或 NSE 染色同时呈阳性反应（图 3），随时间延长，BrdU 阳性细胞数量逐渐减少。MSCs 组 GFAP、NSE 阳 性表达明显高于 HIBD 组（P<0.05），且随时间延 长其表达逐渐增强（P<0.05）（图 4~7）。

图 3　移植后1 周MSCs 组大鼠脑组织内的hUCMSCs 表达（免疫荧光，×400）　　 A：BrdU 阳性细胞同时有 GFAP 阳性表达（箭头所示）；B：BrdU 阳性细胞同时有 NSE 阳 性表达（箭头所示）。

图 4　 组大鼠 GFAP 的表达 （免疫荧光，×400）MSCs 组GFAP 阳性表达明显高于HIBD 组， 且随着时间延长其表达逐渐增强。

图 5 3 组大鼠 NSE 的表达 　　 （免疫荧光，×400） MSCs 组 NSE 阳性表达明显高于 HIBD 组，且 随着时间的延长其表达逐渐增强。

图 6　定量分析 GFAP 的平均荧光强度　　 a 示与假手 术组比较，P<0.05；b 示与 HIBD 组比较，P<0.05；c 示与同组 1 周时比较，P<0.05；d 示与同组 2 周时比较，P<0.05。

图 7　定量分析 NSE 的平均荧光强度　　 a 示与假手术 组比较，P<0.05；b 示与 HIBD 组比较，P<0.05；c 示与同组 1 周 时比较，P<0.05；d 示与同组 2 周时比较，P<0.05。

HIE 是由一系列细胞因子及信号通路共同参 与的复杂连锁反应的结果，其中，最关键的环节 是迟发性细胞损伤所导致的细胞凋亡阶段^[7]，于缺 氧缺血后 24~48 h 达高峰，而 Caspase-3 为细胞凋 亡级联反应中最关键的凋亡效应蛋白酶^[8]。有研究 表明，神经营养因子可以激活酪氨酸激酶受体， 进而启动经典的抗凋亡促存活信号通路 PI3K/Akt， 最终通过抑制凋亡关键酶 Caspase-3 的活化，阻断 细胞凋亡^[4]。另有文献报道，MSCs 可以通过释放 神经营养因子减少细胞凋亡，从而促进濒临死亡 的自体神经元存活^[9]，发挥神经保护与修复作用。

本研究根据文献选择 HIBD 后 24 h 作为移植 时间点，将5 μL hUC-MSCs 悬液（4×10⁴/μL）经 侧脑室移植，对 HIBD 新生大鼠脑组织进行相关检 测。由于 HIBD 后 24~48 h，细胞凋亡达高峰，因此， 本研究以侧脑室移植后 24 h 即 HIBD 后 48 h 作为 初始检测时间点，对细胞凋亡数量及 Caspase-3的 表达进行测定。结果表明：侧脑室移植 48 h 后， MSCs 组的细胞凋亡数量以及 Caspase-3 的表达量 低于 HIBD 组，推测 hUC-MSCs 移植治疗新生大鼠 HIBD 时，借助于多种神经营养因子的释放，早期 可通过抑制 Caspase-3 的表达，减少细胞凋亡，从 而发挥神经保护作用。

新生大鼠 HIBD 的主要损伤部位为海马区域 及大脑皮层。本研究将 BrdU 标记的 hUC-MSCs 移 植入 HIBD 新生大鼠脑组织内，观察到移植后 1、2、 3 周脑组织切片上均可见标记物 BrdU 阳性细胞表 达，其表达量随时间推移而逐渐减少。BrdU 阳性 细胞主要分布于损伤侧海马区域及大脑皮质，偶 见于对侧脑组织，部分移植细胞同时有 GFAP 或 NSE 的阳性表达。MSCs 组 GFAP 及 NSE 阳性表达 明显高于 HIBD 组，而且 MSCs 组移植后 1、2、3 周 GFAP 及 NSE 阳性表达逐渐增强。上述结果表 明，外源性植入 hUC-MSCs 可于脑组织内存活，并 可定向迁徙到受损的海马区域及大脑皮质，可能 与受损脑组织分泌的特异性细胞因子或化学趋化 因子有关^{[10, 11]} 。本研究还发现，植入的 hUC-MSCs 可同时表达 GFAP 或 NSE，表明植入细胞可向神 经元及神经胶质细胞分化，与国内外研究结果相 一致^[1,12] 。有学者认为，hUC-MSCs 参与神经系统 功能的恢复与植入细胞整合入宿主脑内重建神经 与突触网，发挥直接替代作用有关^{[13, 14]}。本研究 尚没有足够证据表明 hUC-MSCs 可直接整合入宿主 脑组织内参与神经环路的组建。本研究结果显示， 移植的 hUC-MSCs 的数量随移植后时间的延长逐渐 减少，而神经样细胞则逐渐增多，推测 HIBD 新生 大鼠神经功能的修复主要与除 hUC-MSCs 早期抑制 Caspase-3 的表达，减少神经细胞凋亡有关外 ^[15]， 更重要的是与 hUC-MSCs 的存活、迁徙、自身分化 为神经样细胞以及后期 hUC-MSCs 促进内源性神经 样细胞的分化均有关。本研究结果显示，BrdU 标 记的阳性细胞越来越少，可推测移植细胞的直接 替代作用可能会较小^[16]，其具体机制尚有待于进 一步的研究。

动物神经行为学的研究是对精神状态、运动 中枢及神经功能的综合评估，可全面反映动物的 整体状态。本研究发现 MSCs 组新生大鼠神经行 为较 HIBD 组有所改善，MSCs 组 Longa 评分低于 HIBD 组，而且随时间的推移这种改善更加明显， 说明 MSCs 随着移植时间的延长可有效促进 HIBD 大鼠神经功能的恢复，这与植入 MSCs 促进神经样 细胞分化的时间基本吻合。由此可见，hUC-MSCs 移植治疗 HIBD 新生大鼠时，可通过早期抑制神经 细胞凋亡，后期定向分化为神经样细胞并促进内 源性神经样细胞的分化，修复损伤脑组织，从而 有效改善 HIBD 新生大鼠的神经行为，为临床应用 hUC-MSCs 移植治疗新生儿 HIE 提供了一定的理论 依据。