随着围产医学的进步，早产儿的存活率显著 提高，其脑损伤问题也倍受关注。脑室周围白质软 化（periventricular leukomalacia,PVL）是早产儿脑 损伤的常见类型。新生期脑白质损伤诱导了星形 胶质细胞活化增殖^[1]。新近研究对新生期 PVL 髓 鞘形成障碍机制提出了新见解：在弥漫性星形胶 质细胞增生的病变区域内少突胶质前体细胞分化 成熟受阻，其发育成熟受阻与星形胶质细胞增生密切相关^[2] 。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）是一种多功能的细胞因子，近年研究 报道 LIF 在中枢神经系统损伤病变中更多显示的 是神经保护作用，被认为是一种神经营养因子^{[3, 4, 5]}。 本课题组前期研究证实 LIF 能够抑制体外氧糖剥 夺培养诱导的原代大鼠星形胶质细胞的增殖^[6]。目 前关于新生期脑损伤后 LIF 表达的研究报道罕见， 且局限于 LIF mRNA 水平，研究时间点亦局限^[3,7]。 本研究拟探讨 PVL 新生大鼠脑组织内源性 LIF 的 表达变化，以及 LIF 在星形胶质细胞表达情况， 进而明确 LIF 是否参与了早产儿 PVL 的损伤或修 复过程，为早产儿脑损伤的研究提供新的理论依 据。 1　材料与方法 1.1　实验动物与分组

健康清洁级3 日龄（P3）Wistar 大鼠，雌雄不限， 购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心； 应用随机数字表法随机分为：对照组（n=80）和 实验组（PVL 组，n=80）。按缺氧缺血（hypoxiaischemia,HI）后 1 d、3 d、7 d、14 d、28 d 再随机 各为分 5 个亚组，每组 16 只。 1.2　仪器与试剂

美国 PTC-100TM 型 PCR 扩增仪、荧光定量 PCR 仪（ABI7500，美国）、美国 OM-25ME 型测 氧仪、日本 Olympus 激光共聚焦显微镜。Trizol 总 RNA 提取液购于 TaKaRa 大连宝生物工程有限公 司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit 购 于 TaKaRa 大 连宝生物工程有限公司；SYBRRPremix ExTaqTM 试剂盒购于 TaKaRa 大连宝生物工程有限公司； GAPDH一抗和HRP标记IgG二抗均购于美国 Santa Cruz；LIF 山羊抗大鼠多克隆抗体（一抗）购 于美国 Santa Cruz 公司，GFAP 小鼠抗大鼠单克隆 抗体（一抗）购于美国 Lab Vision 公司； FITC 标 记兔抗小鼠荧光二抗购于北京中杉金桥生物技术 有限公司；TRITC 标记兔抗山羊荧光二抗购于北 京中杉金桥生物技术有限公司。 1.3　动物模型的制备及标本采集

参照 Bain 等^[3] 方法制备 PVL 动物模型。PVL 组行左侧颈总动脉结扎手术：无水乙醚麻醉，仰 卧于动物手术台上（保持温度为 37℃），局部消 毒后切开约 0.5 cm 长的颈部皮肤，逐层分离出左 侧颈总动脉结扎并切断，缝合切口后置于 37℃恒 温箱内恢复 1 h 后，放置在 2 000 mL 37℃密闭容器 中，以 2 L/min 的速度输入 6％ 02、94％ N₂混合气 体，持续 4 h 后取出返回母鼠笼中饲养。对照组仅 分离左侧颈总动脉，不作结扎及缺氧处理。各时 间点各组大鼠处死前乙醚吸入麻醉，局部消毒后 切开皮肤，依次打开腹腔、横膈、胸腔，暴露心脏， 经左心室以生理盐水灌注至流出液体清亮（用于 制作冰冻切片的标本继续以 4% 多聚甲醛灌注）， 断头取脑；待做 Real-Time PCR 和 Western blot 的 标本置于 -80℃冰箱。 1.4　Real-Time PCR 检测脑组织中 LIF mRNA 的 相对表达

（1）总 RNA 提取 : 将组织剪碎，加入 Trizol 总 RNA 提取液裂解 10 min；加入 200 μL 氯仿， 振荡后室温静置 5 min，12 000 g 4℃离心 15 min； 吸出上清移至 Eppendorf 管内，加入等体积异丙 醇充分混匀，室温静置 10 min，12 000 g 4℃离心 10 min；弃上清，加入 70% DEPC 水配制的乙醇 1 mL，轻轻洗涤管壁，12 000 g 4℃离心 10 min；弃 去乙醇，室温干燥，加入 DEPC 水 20 μL，将沉淀 溶解；取 1 μL 总 RNA 用紫外分光光度计测 260 nm 及 280 nm 的吸光度值，检测 RNA 质量及产量。 （2）反转录（RT）合成 cDNA 第一链：调整 RNA 浓度为 500 ng/μL；RT 反应体系为 5×PrimeScript Buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL， Oligo dT Primer（50uM）1 μL，Random 6mer1 1 μL，RNase free dH₂O 1 μL，Total RNA 2 μL；RT 反 应 条 件 为 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。（3）RealTime PCR 反应：Rea1-Time PCR 引物的设计根据 GenBank 中登录的大鼠 LIF 基因序列设计如下 PCR 引 物：LIF-F 5'-CGGCAACCTCATGAACCAGA-3'， LIF-R 5'-ATGTTGGGCGCACATAGCTTATC-3'； 目 标扩增片段大小为 135 bp，引物由上海生工生物 技术服务有限公司合成。Rea1-Time PCR 反应体系 包括：cDNA2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×） 10 μL，PCR Forward Primer（5 μM）1 1 μL，PCR Reverse Primer（5 μM）1 μL，ROX Reference DyeII （50×）0.4 μL，dH₂O 5.6 μL，总 量 20 μL。PCR 反应参数：95℃ 10 s ；95℃ 5 s，60℃ 34 s；40 个 循环反应。（4）相对定量分析：首先计算△ Ct 值。实验组△ Ct 值 =（实验组目的基因的 Ct 值）-（实 验组内参基因的 Ct 值）；对照组△ Ct 值 =（对照 组目的基因的 Ct 值）-（对照组内参基因的 Ct 值）。 再计算△△ Ct 值 =（实验组△ Ct 值 - 对照组△ Ct 值）。最后计算 2-△△ Ct值，结果即为实验组目的 基因相对于对照组目的基因的相对表达量。 1.5　Western blot 测定脑组织 LIF 蛋白表达

将脑组织机械破碎，每份样本重 50 mg 左右， 每组均 8 份标本，加 6 倍于组织体积的全蛋白裂 解液，4℃超声破碎 12 000 g 4℃离心 30 min，取上 清 2 μL，按 BCA 试剂盒说明测蛋白浓度，以浓度 最低管为基准调节浓度。每孔准备 120 μg 蛋白， 加上样缓冲液煮沸 5 min，上样至聚丙烯酰胺凝胶 中，100 V 电泳约 1.5 h。取出凝胶，于转印液中 平衡 30 min；取出 PVDF 膜，甲醇中浸泡 5 min， ddH₂O 浸泡 3 min，转印液中平衡 5 min；4℃ 40 V 电转印过夜至 PVDF 膜，使用新配制的封闭液室 温封闭2 h，以洗膜液洗5 min；分别加入稀释 的 LIF 和 GAPDH 一抗，4℃孵育过夜；洗膜液洗 膜，5 min×3 次；加入 1 : 3 000 稀释的碱性磷酸酶 标记的二抗，室温杂交 2 h，洗膜液洗膜 3 次，各 5 min；ECL 显色液显色成像；采用 Quantity one-4.4.0 凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳 带的灰度值，以 GAPDH 作为内参，进行分析。 1.6　免疫荧光双标染色检测脑组织 LIF 和 GFAP 蛋白的共表达

取HI 后3 d大鼠脑组织的冰冻切片进行 染色。冰冻切片室温放置15 min 后，甲醇浸泡 30 min； PBS 冲洗 5 min×3 次；将切片浸入 0.01 M 柠檬酸盐缓冲液，于微波炉中加热修复抗原， 间隔10 min，反复2次；冷却至室温后PBS冲 洗 5 min×3 次；滴加 5% BSA 封闭液，室温下孵 育 20 min，甩去多余液体；同时滴加小鼠抗大鼠 GFAP（1 : 100）和山羊抗大鼠 LIF（1 : 75），4℃ 孵育过夜；PBS 冲洗 5 min×3 次；暗室中同时滴 加 FITC 标记兔抗小鼠荧光二抗（1 : 50）和 TRITC 标记兔抗山羊荧光二抗（1 : 50）；室温避光孵育 2 h，PBS 冲洗 5 min×3 次；DAPI 染细胞核，室温 避光 5 min；PBS（pH 7.2~7.6）冲洗 5 min×3 次； 激光共聚焦显微镜下观察。阴性对照：除用 PBS 代替一抗外，其他步骤同上。 1.7　统计学分析

所有数据采用 SPSS 16.0 软件处理，计量资料 以均数 ± 标准差（x±s）表示，两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　动物模型的一般情况

PVL 组新生大鼠在缺氧期间均出现不同程度 的异常反应，表现为皮肤苍白、发绀以及频繁抽搐， 10 只（11%）在缺氧中死亡，随机予以补充 10 只 大鼠。恢复氧供后新生大鼠皮肤迅速转为红润， HI 1 d 后上述异常反应均消失。对照组新生大鼠共 80 只，全部存活，无上述异常表现。苏木精 - 伊 红（HE）染色观察 HI 后大鼠脑组织病理形态学改 变，结果显示：实验组在 HI 后 3 d 左侧（结扎侧） 侧脑室周围白质区开始出现筛网状坏死灶，7 d 开 始出现左侧侧脑室扩大表现，14 d 实验组大鼠病 变程度明显加重，左侧侧脑室较对侧及对照组明 显扩大，左侧脑白质组织结构稀疏模糊，脑室旁 细胞排列紊乱，神经纤维走向紊乱，侧脑室周围 可见囊性疏松坏死区域形成；对照组大鼠左右侧 脑室对称，细胞层次分明，脑白质结构正常，染 色清晰。HI 后 28 d，实验组大鼠病变与 HI 后 14 d 相似，病变程度未见明显加重（图 1）。

图 1　HI 后 14 d 脑组织病理学改变 　　 （HE 染色）　　 PVL 组（B，×40）左侧（结扎侧）侧脑室较对侧和对照组（A， ×40）扩大（箭头所示）。对照组（C，×400）脑白质结构正常， 染色清晰；PVL 组（D，×400）左侧侧脑室周围白质组织结构稀 疏模糊，神经纤维走向紊乱，可见囊性疏松坏死区域形成。图 A、 B 标尺为 500 μm，图 C、D 为 50 μm。

对照组各时间点的LIF mRNA 表达差异无 统计学意义。HI 后 1、3、7 d PVL 组脑组织 LIF mRNA 均高于同时间对照组（t值分别为 9.136、 23.890、11.294，均 P<0.01），HI 后 1 d 时 为 对 照组的 1.51 倍，3 d 时为对照组的 2.01 倍，7 d 时 为对照组的 1.46 倍；14 d、28 d 时与对照组的差 别无统计学意义（t 值分别为 0.445、0.531，均 P>0.05）。PVL 组脑组织 LIF mRNA 表达于 HI 后 3 d 达到高峰，明显高于同组其他时间点，随后 降 低（F=43.037，P<0.01）；HI 后 1 d 高 于 7 d、 14 d 和 28 d（P<0.01）；HI 后 7 d 高 于 14 d 和 28 d（P<0.01）； HI 后 14 d 与 28 d 比较，差异无 统计学意义（P>0.05）（图 2）。

图 2 各组大鼠脑组织 LIF mRNA 的表达变化　 （n=8） 　　a 示与同时间点对照组比较，P<0.01；b 示与同组 1 d 比较， P<0.01；c 示 与 同 组 3 d 比 较，P<0.01；d 示 与 同 组 7 d 比 较， P<0.01。

对照组各时间点的 LIF 蛋白表达差异无统计 学意义。HI 后 1、3、7 d PVL 组脑组织 LIF 蛋白 表达量均高于同时间对照组（t值分别为 9.88、 17.203、3.543，均P<0.01）；HI 后 1 d 时为对照 组的 1.35 倍，3 d 时为对照组的 1.64 倍，7 d 时 为对照组的 1.25 倍；14 d、28 d 时与对照组的差 别无统计学意义（t 值分别为 0.116、0.242，均 P>0.05）；PVL 组脑组织 LIF 蛋白表达量于 HI 后 3 d 达到高峰，明显高于同组其他时间点，随后 降 低（F=42.035，P<0.01）；HI 后 1 d 明 显 高 于 7 d、14 d 和 28 d（P<0.01）；HI 后 7 d 明 显 高 于 14 d 和 28 d（P<0.01）； HI 后 14 d 与 28 d 比较差 异无统计学意义（P>0.05）。见图 3~4。

图 3　各组新生大鼠脑组织 LIF 蛋白的表达变化 （n=8， means±S.E.M）　　a 示与同时间点对照组比较，P<0.01；b 示与 同组 1 d 比较，P<0.01；c 示与同组 3 d 比较，P<0.01；d 示与同组 7 d 比较，P<0.01。

图 4　各组新生大鼠脑组织 LIF 蛋白的表达变化

取HI 后3 d 实验组大鼠8 只，进行脑室周 围白质组织切片的LIF 与GFAP 免疫荧光双标 染色。双标染色结果显示 LIF 与 GFAP 存在共表 达，GFAP 标记的星形胶质细胞表达 LIF 蛋白（图 5~6）。

图 5 PVL 组 HI 后 3 d 脑室周围白质 LIF 与 GFAP 免 疫荧光双标染色 （×40）　　绿色荧光为 GFAP 染色，红色荧 光为 LIF 染色，蓝色荧光为 DAPI 染色（染细胞核），黄色荧光为 GFAP 和 LIF 染色合并后表现；白色菱形区域放大后结果（×400）， 见图6。

图 6　PVL 组 HI 后 3 d 脑室周围白质 LIF 与 GFAP 免疫荧光双标染色 （×400）　　绿色荧光为 GFAP 染色（A）， 红色荧光为 LIF 染色（B），黄色荧光为 GFAP 和 LIF 染色合并后表现（C）；蓝色荧光为 DAPI 染色（染细胞核），A、B 和 C 分别与 DAPI 合并后结果依次为 D、E 和 F；C 和 F 显示 GFAP 和 LIF 共表达。箭头所示为免疫荧光染色阳性细胞。

LIF 是一种多功能的细胞因子，在健康人的 神经系统中难以检测到，但在不同的中枢神经系 统疾病及其动物模型中表达升高^{[8, 9]} 。Alzheimer's 病和 Parkinson's 病患者的神经系统中 LIF 表达增 加^[8]。LIF 蛋白在急性脑卒中病人脑组织中过度表 达，而在其血浆中 LIF 蛋白表达降低^[9]。急性实验 性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠的脊髓 LIF mRNA 表 达上调^[4]。本课题组前期研究证实急性 EAE 大 鼠脑内 LIF 蛋白表达升高^[10]。有关LIF 在新生 期脑损伤疾病中的表达情况，研究报道很少。 Covey ^[7] 等的研究显示新生 7 d 大鼠缺氧缺血脑损 伤后 48 h LIF mRNA 显著升高，但在 72 h 几乎返 回至基线水平。Bain 等^[3] 研究报道了新生 3 d 大鼠 缺氧缺血脑损伤后 7 d 时 LIF mRNA 的表达水平升 高，为对照组的 2.1 倍。本研究则在 mRNA 和蛋 白水平同时探讨了新生 3 d 大鼠 HI 致 PVL 后不同 时间点（1~28 d）LIF 表达的时程变化，发现 LIF mRNA和蛋白在HI 后表达增高，HI 后3 d 时达高峰， 随后逐渐降低，14 d 时降至与对照组无差别。

LIF 在新生期大鼠脑损伤病变中的作用尚不明 确。新生期缺氧缺血性脑损伤是一个多因素、多 机制的级联损伤过程，包括许多环节，如氧自由 基生成、细胞内钙失稳态、兴奋性氨基酸释放， 炎性反应等^[11]。氧自由基参与了新生期缺氧缺血 后神经细胞的损害，研究表明 24~72 h 为氧自由基 损伤最明显时期^[12]。本研究显示缺氧缺血性损伤 后脑组织表达 LIF 的高峰时间正值氧自由基损伤 最明显的时期。目前研究发现 LIF 具有保护星形 胶质细胞免受氧化应激损伤的作用^[13]。本研究显 示 PVL 新生大鼠脑组织内源性 LIF 于 HI 后 3 d 时 表达最高，这一结果可能反映了 LIF 在新生期脑 损伤病变中发挥保护作用。

LIF 能够促进神经干细胞（neural stem cells, NSCs）的自我更新和分化 ^{[14, 15]}，促进新生期脑室 下区神经干细胞的增殖，增殖的神经干细胞能够 分化为神经细胞而修复脑损伤病变^[3,7]。本研究显 示 PVL 新生大鼠脑组织内源性 LIF 仅一过性表达 升高，不能持续促进神经干细胞的增殖，可能也 反映了内源性修复机制的不足^[7]。

新生期脑白质损伤后星形胶质细胞过度增殖， 影响神经细胞的再生，抑制损伤病变的修复^{[1, 2]}。 本课题组前期研究证实外源性 LIF 能够抑制氧糖 剥夺培养后星形胶质细胞的增殖^[6]。本研究发现 PVL 新生大鼠脑组织内源性 LIF 仅一过性表达升 高，难以持续抑制星形胶质细胞的增殖，可能反 映了内源性保护机制的不足。

体外研究显示，脂多糖及 TNFα 能够通过激 活核转录因子 NF-kB 的机制诱导大鼠星形胶质细 胞表达 LIF 增高，谷氨酸能够以钙离子作为信号 转导的第二信使分子促进大鼠大鼠星形胶质细胞 表达 LIF^[16]。钙离子是机体细胞内参与机能调节的 第二信使之一，缺氧缺血性脑损伤时可发生细胞 内钙离子稳态失调；脑缺氧缺血损伤时机体产生 一系列内源性损伤因子，如活性氧、细胞因子、 谷氨酸等，这些因子均可活化 NF-kB ^[12]。GFAP 是 星形胶质细胞标志物，本研究通过免疫荧光双标 染色检测到 LIF 与 GFAP 共表达。因此本研究推测 新生大鼠缺氧缺血性脑质病损伤早期可能通过钙 离子作为第二信使分子或激活 NF-kB 机制调节脑 组织星形胶质细胞表达 LIF 蛋白，但具体机制尚 待进一步研究证实。

本研究结果提示，LIF 可能参与了 PVL 病变 修复过程，但其具体作用及机制仍待进一步深入 研究。外源性 LIF 可能成为新生期脑白质损伤疾 病治疗的新手段。