新生儿持续性肺动脉高压（persistent pulmonary hypertension,PPH） 是新生儿期常 见的危重病症之一，发生率占活产婴儿的 1/1 200~2/1 200^[1]，病死率高。研究表明，围生期 窒息缺氧是新生儿PPH 发生的主要原因之一^[2]。 目前新生儿PPH 发病机制尚不清楚，关于 11β-HSD2 及肾素- 血管紧张素- 醛固酮等相关 信号分子在新生儿PPH 发病中的研究鲜有文献报 道。11β-HSD2 是糖皮质激素代谢的关键酶之一， 可通过调节局部组织器官中的糖皮质激素水平来 影响血管功能，低氧状态可负向调控11β-HSD2 的表达。本研究在采用缺氧加吲哚美辛联合诱导 胎鼠肺动脉高压模型的基础上，从11β-HSD2 的 角度出发，通过检测PPH 新生大鼠血清中皮质醇 以及肺组织中前列环素、肾素、血管紧张素、醛 固酮的浓度，探讨11β-HSD2 及相关信号分子在 新生儿PPH 发病中的作用，从而为新生儿PPH 的 临床诊治及预防提供理论基础。

Sprague-Dawley（SD）清洁级雌鼠10 只，雄 鼠5 只，约8 周龄，体重210~230 g，购自新疆医 科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK ［新］2003-0001。适应性喂养1 周后，于上午 10:00 合笼，次日上午10 : 00 查阴道脱落细胞并进 行涂片，以查到精子记为孕0 d。孕鼠分笼饲养， 共孕6 只，随机分配为对照组和PPH 组各3 只， 获取对照组新生大鼠28 只，PPH 组新生大鼠31 只。 分别从对照组和PPH 组随机抽取15 只仔鼠用于实 验处理。

主要试剂包括吲哚美辛（Sigma, BCBF9122V）、兔多克隆抗大鼠11β-HSD2（美 国Santa Cruz，LO909）、FITC 标记抗兔（ 北京 中杉金桥，106103）、Propidium Iodide（Sigma, SLBD2912V）、大鼠血管紧张素、皮质醇、肾素、 醛固酮ELISA 试剂盒（优尔生，武汉）及前列环 素ELISA 试剂盒（西唐，上海）。

主要仪器包括恒温水浴箱、酶标仪、低温台 式离心机（Thermo-scientific,USA）、激光共聚焦 显微镜、冰冻切片机、微量加样器等。

采用缺氧加吲哚美辛建立胎鼠肺动脉高压模 型^[2]。在妊娠的第19 天，孕鼠被随机分为PPH 组 和对照组。PPH 组：妊娠第19 天将大鼠置于12% 氧浓度的有机玻璃盒中，保持箱内温度25~27℃， 湿度50%~70%，孕鼠可在箱内自由饮食。每天定 时添加水、饲料及更换垫料。腹腔内注射吲哚美 辛0.5 mg/kg，每日两次，连续3 d。对照组：妊娠 第19 天将大鼠置于空气中，腹腔内注射与PPH 组 孕鼠相同体积的生理盐水，其他条件与PPH 组一 致。妊娠第22 天，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg 麻醉孕鼠并迅速剖腹取出仔鼠（剔除提前出生的 仔鼠）。新生仔鼠处死后立即取出左肺，将其液 氮速冻后-80℃保存。右肺组织被取出后用4 % 多 聚甲醛固定至少24 h，用于苏木精- 伊红（HE） 染色和免疫组化。同时取心脏进行HE 染色病理检 测。并通过比较PPH 组与对照组新生大鼠右心室 游离壁厚度及肺组织中肺小动脉中膜厚度/（中膜 + 内腔）厚度比值的差异进行模型验证。

在激光共聚焦显微镜下观察11β-HSD2 在新 生大鼠肺组织中的表达。取新生大鼠新鲜肺组织 进行冰冻切片（4~5 μm），储存于-20 ℃冰箱中 待用。将冰冻切片取出，静置10 min，待切片回 温和干燥，浸于PBS 中震洗3 次，每次5 min，用 吸水纸吸干组织周围多余的PBS，加入一抗兔抗 大鼠11β-HSD2（1 : 200），在4 ℃冰箱中过夜， 然后冲洗一抗，在浸于PBS 中震洗3 次，每次 5 min，用吸水纸吸干组织周围多余的PBS，加入 二抗山羊抗兔（1 : 50），将切片置于暗盒中37℃ 孵育45 min，用PBS 洗去二抗，用吸水纸吸干组 织周围多余的PBS，用10 μg/L Propidium Iodide 封片。在激光共聚焦显微镜下观察，并采用AIM Image Examiner 软件对扫描图像进行量化分析。

应用ELISA 检测血清皮质醇及肺组织前列环 素、肾素、血管紧张素、醛固酮的浓度。采用断 头取血法将新生大鼠血液放置于抗凝管中，混匀， 静置20 min 后3 000 g 离心20 min，取上清，贮存于-80℃。严格按皮质醇说明书检测血清中的皮质 醇的含量。取1 g 肺脏组织，加入5 mL 0.01 M PBS （pH=7.4），匀浆后5 000 r/min 离心20 min，取上清， 按照试剂盒说明书操作，在450 nm 波长下测定吸 光度（OD 值），计算新生大鼠肺组织中前列环素、 肾素、血管紧张素、醛固酮的浓度。

采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，数 据以均数± 标准差（x±s）表示，两组间比较采 成组t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

缺氧后，新生大鼠右心室出现肥厚，肺小动 脉管壁增厚。HE 染色结果显示：与对照组相比， PPH 组新生大鼠右心室游离壁厚度增高，差异有 统计学意义（P<0.01）。新生大鼠肺小动脉中膜厚 度/（中膜+ 内腔）厚度增大，差异有统计学意义 （P<0.01）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 两组右心室游离壁厚度及肺小动脉中膜厚度/（中膜+ 内腔）厚度的比较 （x±s）

表 1 37 例移植患儿一般情况

激光共聚焦显微镜下显示11β-HSD2 在两 组新生大鼠肺组织中广泛表达，主要表达在肺血 管上皮细胞、肺泡上皮细胞及支气管上皮细胞胞 浆内，见图 1C、F。PPH 组11β-HSD2 表达较对 照组减少，见图 1A、D。对照组、PPH 组新生大 鼠肺组织中11β-HSD2 的平均荧光强度分别为 200±23、72±31，两组比较差异有统计学意义 （t=11.477，P<0.01）。

图 1 激光共聚焦显微镜定位11β-HSD2 的表达（×200）与对照组( 图A) 相比，PPH 组（ 图D）11β-HSD2 阳性细胞的表达减少。图B、E 显示了核染色定位肺血管、肺泡及支气管上皮细胞。图C、F 显示11β-HSD2 主要是在肺血管上皮细胞（白色箭头所示）、肺泡上皮细胞（蓝色箭头所示）及支气管上皮细胞（红色箭头所示）胞浆内表达。

与对照组比较，PPH 组新生大鼠血清皮质醇 浓度升高，差异有统计学意义（P<0.05）；PPH 组肺组织中前列环素的水平降低，差异有统计学 意义（P<0.01）；肾素、血管紧张素、醛固酮的水 平增高，差异有统计学意义（均P<0.01），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 两组血清皮质醇及肺组织前列环素、肾素、血管紧张素、醛固酮浓度的比较 （x±s）

表 1 37 例移植患儿一般情况

本研究采用缺氧加吲哚美辛联合诱导的方法 建立胎鼠肺动脉高压模型。病理学研究结果显示： PPH 组新生大鼠右心室游离壁及肺小动脉管壁较 对照组显著增厚，表明胎鼠肺动脉高压模型建立 成功。相关研究认为缺氧导致肺微小动脉内皮损 伤，进而引起血管内皮功能失调，使得血管活性 物质及细胞因子产生及释放异常，血管舒缩平衡 因子失调，作用于血管平滑肌，早期表现为肺血 管收缩，后期表现为肺血管壁病理改变及肺血管 重建^{[3, 4]}。

本研究结果显示：与对照组相比，PPH 组新 生大鼠肺组织中11β-HSD2 的表达降低，新生大 鼠血清中皮质醇的浓度升高。目前关于11β-HSD2 调控皮质激素的研究主要集中在胎盘，胎盘 11β-HSD2 在降低母体皮质醇水平从而保护胎儿 在宫内的正常生长发育提供重要作用^[5]。在胎儿宫 内生长迟缓和先兆子癎等病理状态的胎盘组织中， 11β-HSD2 表达量和酶活性明显低于正常胎盘组 织^{[6, 7]}。已有研究证实胎儿各种组织器官包括肺脏 均有11β-HSD2 表达^[8]，提示宫内缺氧也可能导 致肺脏11β-HSD2表达减少从而影响肺血管功能。 本研究证实了11β-HSD2 主要是在新生大鼠肺组 织中肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及肺血管上 皮细胞胞浆中表达。

在体内，健康人外周血管阻力的维持需要少 量的皮质激素。11β-HSD2 是糖皮质激素代谢的关 键酶之一，为专一氧化酶。在糖皮质激素作用的 调节中，11β-HSD2 的激活和调节起着关键作用^[9]。 11β-HSD2 的表达障碍可以导致皮质醇灭活减少， 缺氧抑制了肺组织中11β-HSD2 的表达和活性， 使皮质醇浓度增加，并且还可以通过活化盐皮质 激素受体导致高血压^[10]。根据相关报道，过多的 皮质醇可通过抑制内皮细胞前列环素等血管舒张 因子的产生，同时通过与其受体结合并激活该受 体进而增加血管平滑肌细胞上的α 肾上腺素受 体、血管紧张素II 受体等缩血管物质，从而增加 血管的缩血管效应，最终诱导高血压的发生和发 展^{[11, 12]}。在活体研究中也显示，抑制血管内皮细 胞的11β-HSD2，可通过反应级联以自分泌的方 式使血管收缩，还会导致血管紧张素II 和肾上腺 素反应加强^[13]，血管紧张素Ⅱ促进血管收缩和肾 上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮可促进钠、水重吸收， 引起血压增高。前列环素与多种肺部疾病相关^{[14, 15]}， 它主要由内皮细胞分泌，具有强大的扩张血管,抑 制血小板聚集及细胞黏附的作用，不仅能预防血 栓形成，还能直接作用于平滑肌细胞，进而促使 血管扩张。近年来证实气管内应用前列环素能选 择性降低肺血管阻力^[16]，应用前列环素类药物（如 前列地尔）能够有效地治疗新生儿PPH^[17] 及低氧 性肺动脉高压^[18]。本研究结果显示，PPH 组肺组 织中前列环素水平较对照组降低，肾素、血管紧 张素、醛固酮水平较对照组升高，表明11β-HSD2 通过影响前列环素、肾素、血管紧张素、醛固酮 参与新生儿PPH 的发病机制，可能成为干预新生 儿PPH 病情进展的另一个新途径。

综上所述，11β-HSD2 在新生大鼠肺组织中 广泛表达。PPH 新生大鼠肺组织中11β-HSD2 的 表达减低，使新生大鼠血清皮质醇浓度升高。过高浓度的皮质醇一方面通过抑制肺血管内皮细胞 分泌舒血管物质，另一方面又通过激活α 肾上腺 素、血管紧张素II 等缩血管物质，使肺血管舒缩 功能失衡，持续处于收缩状态，肺血管压力升高， 进而造成肺动脉高压。血管紧张素II 又促进了肾 上腺皮质分泌醛固酮，造成体内水钠潴留，进一 步增加了肺血管的压力。